重組人內(nèi)抑素對兔耳增生性瘢痕成纖維細胞凋亡的作用及機制研究.pdf

1、增生性瘢痕(hypertrophic scar, HS)是一種皮膚軟組織損傷之后機體過度修復(fù)導(dǎo)致的皮膚纖維化疾病，手術(shù)后的發(fā)病率可達40%-70%，而燒傷后的發(fā)病率更高達91%。HS主要的臨床表現(xiàn)為損傷局部組織凸于正常皮膚的異常增生，并伴有疼痛、瘙癢等機體感覺不適，同時給患者帶來局部組織外觀和功能上的改變，如局部關(guān)節(jié)部位的瘢痕性攣縮等，嚴(yán)重影響了患者的身心健康。其確切的發(fā)病原因和機制目前尚未完全明確，臨床上也缺乏特異性的治療措施，而單純

2、的手術(shù)切除會產(chǎn)生新的瘢痕。增生性瘢痕成纖維細胞(hypertrophic scar fibroblasts, HSFs)是HS發(fā)生和發(fā)展過程中的主要效應(yīng)細胞，且HSFs增殖和凋亡之間的不平衡也是臨床上HS過度增生和持續(xù)存在的重要原因，因而抑制HSFs增殖和(或)促進HSFs凋亡可以成為臨床上治療HS的一個重要突破口。
　　內(nèi)抑素(endostatin)是 O’Reilly等人從小鼠血管內(nèi)皮瘤細胞的培養(yǎng)上清液中分離純化得到的一種蛋白

3、質(zhì)，共184個氨基酸殘基。先前的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)抑素可特異性抑制血管內(nèi)皮細胞增殖，通過進一步的研究證實，內(nèi)抑素可以直接抑制部分腫瘤細胞增殖、遷移并誘導(dǎo)凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。我們早期的研究證實重組人內(nèi)抑素(recombinant human endostatin, rhEndostatin)可特異性抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡；Ren等證明內(nèi)抑素可以通過降低瘢痕組織中bcl-2的表達和抑制瘢痕內(nèi)新生血管的形成來抑制瘢痕

4、的增生。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)rhEndostatin(6.25,12.5,25,50,100μg/ml)可以直接抑制HSFs增殖，本實驗正是在本課題組前期研究的基礎(chǔ)上進一步探討 rhEndostatin(100μg/ml)對兔耳HSFs凋亡的作用并探討其中凋亡相應(yīng)的分子機制，從而為HS的臨床治療以及尋找藥物治療新靶點提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　目的：觀察rhEndostatin對HSFs凋亡的影響，探討其作用的部分細胞與分子機

5、制。
　　方法：①HS模型制備與鑒定：新西蘭大耳兔8只，分為正常組(2只)和HS模型組(6只)，模型組大耳兔建立兔耳HS模型；術(shù)后第28天，瘢痕形成；隨機取兩只兔耳瘢痕組織和正常兔耳皮膚行組織學(xué)觀察，鑒定HS。
　?、贖SFs分離培養(yǎng)和鑒定：采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)細胞，取第3代(傳2代)細胞行波形蛋白免疫細胞化學(xué)染色鑒定HSFs。后續(xù)實驗采用第3代細胞。
　?、跦SFs凋亡情況檢測：將模型組細胞分為未處理組、內(nèi)抑素處理組

6、(100μg/ml)和5-氟尿嘧啶處理組(500μg/ml)，流式細胞儀(FCM)對細胞凋亡情況進行檢測。
　?、?HSFs凋亡相關(guān)基因與蛋白檢測：實時熒光定量 PCR法檢測 c-fos, c-jun, NF-κB, fas, caspase-3, bcl-2和p53 mRNA；Western Blot法檢測相應(yīng)蛋白表達。
　?、軭SFs胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+檢測：Fluo-4/AM作為Ca2+指示劑，其終濃度為100?g/ml

7、rhEndostatin灌流 HSFs，同時用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope, CLSM)動態(tài)觀察和記錄HSFs在有無Ca2+液時胞質(zhì)中的Ca2+熒光強度(fluorescence intensity, FI)變化，檢測rhEndostatin對HSFs胞質(zhì)Ca2+濃度(cytosolic free calcium concentration)[Ca2+]i的影響。
　　結(jié)果

8、：①術(shù)后28天，HS即形成。HE染色結(jié)果顯示瘢痕組織較周圍正常皮膚明顯增厚，同時瘢痕組織內(nèi)的膠原纖維也明顯變粗變大，呈現(xiàn)出旋渦或結(jié)節(jié)狀，形成膠原結(jié)節(jié)；同時伴有大量的成纖維細胞增殖以及小血管增生。
　?、诓ㄐ蔚鞍酌庖呒毎瘜W(xué)染色對第3代(傳2代)細胞進行鑒定的結(jié)果顯示：細胞胞質(zhì)內(nèi)含有大量的棕黃色顆粒，呈現(xiàn)成纖維細胞特性。
　　③ FCM分析結(jié)果顯示，rhEndostatin(100μg/ml)可促進HSFs早期及晚期凋亡，且以

9、早期凋亡更為顯著,分別為(10.78±0.06)%、(2.12±0.04)%，差異較未處理對照組HSFs均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　?、軐崟r熒光定量PCR及Western Blot分析結(jié)果顯示，與未處理對照組HSFs相比較，rhEndostatin(100μg/ml)能明顯降低 HSFs c-jun, c-fos, NF-κB, fas, p53, caspase-3和bcl-2 mRNA和蛋白的表達水平(P<0.01)

10、。
　?、?CLSM檢測結(jié)果顯示，當(dāng)細胞處于無 Ca2+液(D-Hanks緩沖液)中時，rhEndostatin(100?g/ml)不能引起HSFs胞質(zhì)內(nèi)Ca2+FI的改變。當(dāng)細胞外緩沖液為有Ca2+液(Hanks緩沖液)時，終濃度為100?g/ml rhEndostatin灌流HSFs可使胞質(zhì)Ca2+FI急劇增加達峰值，隨即熒光開始減弱，F(xiàn)I隨時間而緩慢下降。
　　結(jié)論：① rhEndostatin可促進HSFs凋亡。