重組克胰素的基因工程表達(dá)及藥效學(xué)研究.pdf

1、第一章重組克胰素的真核表達(dá)和鑒定 目的：構(gòu)建克胰素真核表達(dá)體系，純化和鑒定重組克胰素，探索規(guī)模化重組克胰素制備技術(shù)。 方法：根據(jù)克胰素的cDNA序列，設(shè)計(jì)引物，在虎紋蜘蛛毒素的cDNA文庫(kù)中，用PCR擴(kuò)增基因，并將目的DNA與載體pVT102U連接構(gòu)建質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入釀酒酵母S-78酵母菌，在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)的菌液經(jīng)離心、過(guò)濾、陽(yáng)離子交換、反相HPLC分離后凍干保存。通過(guò)MALDI-TOF測(cè)定分子量、N-末端序列

2、測(cè)定以及SDS-PAGE和反相HPLC等分析對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。 結(jié)果：1、構(gòu)建目的DNA與載體pVT102U連接的質(zhì)粒pVT-HW11； 2、獲得高效表達(dá)重組克胰素的菌種，平均產(chǎn)率約為13 mg/L； 3、建立由離心、過(guò)濾、陽(yáng)離子交換、反相HPLC分離組成的簡(jiǎn)單可行的純化方法，產(chǎn)物純度超過(guò)98％； 4、重組克胰素與天然多肽具有相同的分子量和氨基酸序列。 結(jié)論成功構(gòu)建克胰素釀酒酵母S-78酵母菌真

3、核表達(dá)體系，表達(dá)穩(wěn)定高效；建立了簡(jiǎn)單有效的純化方法；經(jīng)鑒定重組克胰素與天然克胰素分子量和氨基酸序列相同。重組克胰素具備規(guī)模化制備的可能。本研究有開創(chuàng)性和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 第二章重組克胰素的藥效學(xué)研究 目的：研究重組克胰素的生物學(xué)活性，探討其臨床應(yīng)用前景。 方法：用酶和特定的底物反應(yīng)原理，采用分光光度計(jì)可以測(cè)量產(chǎn)物的生成量。測(cè)定重組克胰素和牛胰蛋白酶抑制劑(bovine pancreatictrypsin inhib

4、itor，BPTI)抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、組織激肽釋放酶、凝血酶等絲氨酸蛋白酶的抑制常數(shù)，從而衡量其酶抑制活性的強(qiáng)弱。重組克胰素抑制胰蛋白酶的活性極強(qiáng)，無(wú)法采用分光光度法準(zhǔn)確測(cè)定抑制動(dòng)力學(xué)，因此通過(guò)等溫滴定量熱法，從熱變化的角度對(duì)重組克胰素與胰蛋白酶的結(jié)合動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，同時(shí)也通過(guò)這種方法比較了重組克胰素和BPTI的胰蛋白酶抑制能力；構(gòu)建L-Arg誘導(dǎo)的小鼠急性胰腺炎模型，從生化指標(biāo)、病理切片方面觀察重組克胰素對(duì)急性胰腺炎的藥效；

5、應(yīng)用膜片鉗技術(shù)，研究重組克胰素在全細(xì)胞模式下對(duì)于大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)細(xì)胞上的電壓門控鉀離子通道的作用，包括不同電壓下、不同重組克胰素濃度下的抑制效果。 結(jié)果：1、重組克胰素和BPTI對(duì)胰蛋白酶活性均有明顯的抑制作用，但重組克胰素對(duì)胰凝乳蛋白酶、組織激肽釋放酶、凝血酶活性的抑制作用低于BPTI，而對(duì)胰蛋白酶活性的抑制作用重組克胰素比BPTI強(qiáng)30倍，是目前發(fā)現(xiàn)的較強(qiáng)的胰蛋白酶抑制劑。 2、重組克胰素能明顯降低急性胰腺炎

6、小鼠血清淀粉酶和脂肪酶的活性，主要通過(guò)對(duì)胰蛋白酶的抑制，早期給藥可顯著降低胰腺高分泌狀態(tài)及保護(hù)自身消化損傷的胰腺細(xì)胞，對(duì)小鼠急性胰腺炎有明顯保護(hù)作用，且能明顯改善其病理表現(xiàn)。 3、重組克胰素對(duì)于電壓門控鉀離子通道的阻斷作用呈現(xiàn)濃度依賴性，10-6M濃度鉀電流下降達(dá)到飽和(達(dá)到最強(qiáng)抑制效果)，重組克胰素完全抑制胰蛋白酶活性的濃度為10-12M，提示對(duì)電壓門控鉀離子通道有較弱抑制作用，在發(fā)生胰蛋白酶抑制效用時(shí)，產(chǎn)生與鉀通道藥理有關(guān)副