腫瘤基因工程納米乳劑疫苗的藥效學研究.pdf

1、惡性腫瘤嚴重威脅人類生命和健康。惡性腫瘤的三大傳統(tǒng)療法-手術、放療和化療，治療效果并不理想。隨著免疫學、細胞生物學及分子生物學的飛速發(fā)展，腫瘤疫苗的研制與應用已成為治療腫瘤復發(fā)、轉移的有力手段。但由于存在缺乏特異性腫瘤抗原和有效的抗原提呈，以及MHC限制性、腫瘤異質性、疫苗生物利用度差等問題，使得現有疫苗的免疫效果不盡人意。黑色素瘤抗原(MelanomaAntigen，MAGE)是首先被發(fā)現的人類腫瘤特異性抗原，MAGE-1是MAGE家

2、族的重要成員之一，廣泛表達于多種組織的腫瘤，而在除睪丸和胎盤外的正常組織中均不表達，是腫瘤特異性免疫治療理想的靶分子。目前，基于MAGE-1的腫瘤疫苗能誘導MAGE-1特異性CTL的產生，在腫瘤免疫治療方面倍受重視。熱休克蛋白(HeatShockProtein，HSP)具有分子伴侶作用，參與腫瘤抗原的加工遞呈，在誘導腫瘤免疫反應中發(fā)揮重要作用；最近研究表明，制備結核桿菌HSP70與目的抗原融合蛋白是提高疫苗效能的有效方法。超抗原SEA可

3、有效激活CD4+T細胞，協同加強腫瘤抗原的免疫效果。納米載藥系統(tǒng)是近年來蓬勃發(fā)展起來的全新的藥物載體，可有效提高所載藥物，特別是蛋白質藥物的生物利用度，與傳統(tǒng)載藥系統(tǒng)相比有很多優(yōu)點。 本研究首先以腫瘤特異性抗原MAGE-1與熱休克蛋白HSP70的融合蛋白為基礎，與超抗原葡萄球菌腸毒素A(SEA)按摩爾比100∶1制成復合抗原(MHS)；再以納米乳劑為藥物載體包裹MHS，制備出油包水型(W/O)納米乳劑疫苗NE(MHS)，著重對其

4、進行藥效學實驗研究，為新型廣譜腫瘤基因工程納米疫苗臨床前研究奠定基礎。 1.納米乳劑疫苗的劑量與抗腫瘤效應間的量效關系目的：觀察NE(MHS)與荷B16-MAGE-1腫瘤C57BL/6小鼠腫瘤抑制率之間的劑量-效應關系，確定腫瘤抑制率分別為30％和50％的有效劑量和半數有效量(ED50)，并明確高劑量給藥后小鼠的毒性反應。方法：磁力超聲法制備包裹復合抗原疫苗(融合蛋白MAGE-1/HSP70與超抗原SEA按摩爾比100∶1混合)

5、的油包水型納米乳劑NE(MHS)，并評價其粒徑、包裹率及穩(wěn)定性；將NE(MHS)腹腔注入荷B16-MAGE-1腫瘤C57BL/6小鼠體內，設低、中、高3個劑量組，以明確NE(MHS)劑量與腫瘤抑制率間的關系，求得抑瘤率分別為30％和50％的有效劑量和半數有效量(ED50)；觀察高劑量治療組小鼠的一般毒性反應，檢查血常規(guī)、肝、腎功，并剖檢動物，計算臟器指數，重要臟器行病理學觀察。結果：①成功制備出粒徑為20±5nm的納米乳劑，其藥物包裹率

6、為87％，于4℃放置6個月后或3000rpm10分鐘離心后無分層，證明其穩(wěn)定性良好；②中、高劑量組的平均抑瘤率均大于30％，且和陰性對照組有顯著性差異，三組劑量的對數值和腫瘤抑制率呈線性關系且具有劑量依賴性：③與PBS對照組相比，高劑量治療組小鼠未見明顯毒性反應。結論：該腫瘤基因工程納米乳劑疫苗具有良好的理化性質，能有效地抑制腫瘤生長，并使用安全，是一種很有希望的新型抗腫瘤疫苗。 2.納米乳劑疫苗的抗腫瘤免疫學效應研究目的：評價

7、NE(MHS)的抗腫瘤免疫學特性。方法：以疫苗免疫動物，IFN-γELISPOT和LDH殺傷實驗檢測疫苗激活機體特異性細胞免疫反應，ELISA法檢測體液免疫反應；腫瘤治療、攻擊實驗以及預防腫瘤轉移和切除后復發(fā)實驗檢測納米乳劑疫苗的抗腫瘤效應；流式細胞儀檢測脾臟中CD4+、CD8+T細胞情況；RT-PCR檢測腫瘤局部組織IL-2，IFN-γ和TNF-α的表達。結果：與其它組相比，NE(MHS)組小鼠脾淋巴細胞中分泌IFN-γ的T細胞數量明

8、顯增多(P＜0.05)，CTL對B16-MAGE-1的特異性殺傷作用明顯增強，MAGE-1抗體水平較NE(MH)、MH、NE(-)和PBS組明顯增高(P＜0.05)；在腫瘤治療實驗中，NE(MHS)組B16-MAGE-1腫瘤體積明顯小于其它組，荷瘤小鼠生存期顯著大于其它組(P＜0.01)；在腫瘤攻擊實驗中，NE(MHS)組B16-MAGE-1腫瘤成瘤時間長、成瘤率低；在預防腫瘤轉移和預防腫瘤切除后復發(fā)實驗中，與其它組小鼠相比，NE(MH

9、S)免疫后小鼠B16-MAGE-1肺臟轉移結節(jié)數明顯減少(P＜0.01)，腫瘤切除后復發(fā)時間延遲，復發(fā)率明顯降低；流式細胞術檢測NE(MHS)免疫后小鼠脾臟CD4+和CD8+T細胞增多，并以CD8+T細胞增多為主；NE(MHS)免疫后的小鼠腫瘤局部組織經RT-PCR檢測有明確IL-2和TNF-α的表達。結論：NE(MHS)能夠刺激機體產生強烈的MAGE-1特異性的細胞免疫和較強的體液免疫反應，對表達MAGE-1的腫瘤細胞具有更強的殺傷作

10、用，對荷瘤小鼠有很好的治療作用，能有效預防腫瘤攻擊、腫瘤轉移和腫瘤切除后復發(fā)。 3.納米乳劑疫苗經不同途徑免疫的抗腫瘤免疫學效應研究目的：評價NE(MHS)經不同途徑免疫小鼠后的抗腫瘤免疫學特性，探索腫瘤納米乳劑疫苗全新、有效的給藥途徑。方法：小鼠經口服(p.o.)、靜脈(i.v.)、皮下(s.c.)、腹腔(i.p.)4種途徑以NE(MHS)免疫，IFN-γELISPOT和LDH殺傷實驗檢測疫苗激活機體特異性細胞免疫反應的情況；

11、腫瘤治療、攻擊實驗評價疫苗的抗腫瘤效應。結果：治療實驗中，B16-MAGE1接種后第28天，與注射免疫的其他3組相比，口服組小鼠腫瘤體積較大(P＜0.05)；除此，IFN-γELISPOT、LDH殺傷實驗和腫瘤攻擊實驗中各項指標，經4組小鼠組間比較，均無統(tǒng)計學差異。結論：納米乳劑疫苗NE(MHS)經不同途徑給藥后免疫效果相近，NE(MHS)適用于多種途徑給藥，是一種使用方便的腫瘤基因工程納米疫苗。 綜上所述，本研究成功制備出粒徑

12、為20±5nm的W/O型納米乳劑疫苗NE(MHS)，其穩(wěn)定性良好，藥物包裹率較高；NE(MHS)能有效抑制腫瘤生長，與荷B16-MAGE-1小鼠腫瘤抑制率間具有很好的量效關系；NE(MHS)能誘導機體產生強烈的MAGE-1特異性CTL，對表達MAGE-1的腫瘤具有良好的治療和預防作用；以不同的方式免疫小鼠后，NE(MHS)的短期抗腫瘤免疫學特性相近。本研究為研制高效、生物利用度高、使用安全、方便的腫瘤疫苗開辟了新途徑，為本疫苗的臨床前研