RGD序列肽修飾的蠶絲人工韌帶在兔ACL重建中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的
　　將RGD多肽結(jié)合于絲素蛋白材料表面，實(shí)現(xiàn)對(duì)蠶絲韌帶的改性，提高BMSC的粘附與鋪展效率，并應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的前交叉韌帶重建實(shí)驗(yàn)，為組織工程化蠶絲人工韌帶的進(jìn)一步制備研究提供理論依據(jù)。
　　方法
　　取一周左右新西蘭大白兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，傳代培養(yǎng)并行流式細(xì)胞儀及免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞種類。以EDC/NHS將絲素蛋白中的羧基活化，以PBS液配制的GRGDSPC對(duì)蠶絲韌帶進(jìn)行表面修飾。取6根RGD序列肽修飾的蠶絲韌帶置于

2、6孔板內(nèi)作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)取6根未經(jīng)修飾的蠶絲韌帶置于另一六孔板內(nèi)作為對(duì)照組，取第三代BMSCs細(xì)胞懸液均勻滴加于蠶絲韌帶上并置于細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4h和12h后，分別通過消化法收集細(xì)胞懸液通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
　　取第四代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，人工蠶絲韌帶復(fù)合7天，形成BMSC-蠶絲韌帶復(fù)合材料。選取新西蘭大白兔36只（均經(jīng)檢疫合格），將其隨機(jī)分為三組（實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組），每組12只。實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用RGD序列肽修飾的復(fù)合材料，對(duì)

3、照組為未經(jīng)修飾的復(fù)合材料，空白組為單純蠶絲韌帶。各組均于無菌條件下重建右側(cè)前交叉韌帶。術(shù)后4W、8W、16W后取出移植物，分別行大體觀察、組織學(xué)及生物力學(xué)檢測(cè)。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均通過SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果
　　1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
　　貼壁法分離并提純BMSCs，置于倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈不規(guī)則梭形。免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示CD34陰性，CD44、CD50陽性，表現(xiàn)為干細(xì)胞特性。<

4、br>　　2、人工蠶絲韌帶對(duì)BMSCs的粘附率
　　消化法測(cè)定細(xì)胞粘附率，結(jié)果顯示:4h時(shí)的粘附率實(shí)驗(yàn)組0.26±0.05，對(duì)照組0.12±0.03，P＜0.01;12h時(shí)的粘附率實(shí)驗(yàn)組0.46±0.04，對(duì)照組0.21±0.02，P＜0.01。經(jīng)RGD肽修飾的蠶絲韌帶粘附率明顯高于未經(jīng)修飾的蠶絲韌帶，通過t檢驗(yàn)分析，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3、移植物取材觀察
　　術(shù)后4W，實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)腔內(nèi)疏松結(jié)

5、締組織生長(zhǎng)較為明顯，韌帶局部被滑膜所包裹，韌帶兩端在骨道內(nèi)穩(wěn)定，切片顯示大量炎癥細(xì)胞，以粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞為主，韌帶本身可見少量彈性纖維在蠶絲束間出現(xiàn)。對(duì)照組關(guān)節(jié)腔內(nèi)疏松結(jié)締組織出現(xiàn)，不過韌帶表面滑膜包繞不明顯，切片見大批炎性細(xì)胞聚集，韌帶未見顯著性纖維長(zhǎng)入?？瞻捉M韌帶表面無滑膜包繞，切片可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，韌帶未見明顯纖維長(zhǎng)入。術(shù)后8W，實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜明顯增生并包繞韌帶，關(guān)節(jié)內(nèi)滑液清亮，部分致密結(jié)締組織長(zhǎng)入韌帶，切片見炎癥細(xì)胞明顯減少

6、，韌帶纖維結(jié)構(gòu)與蠶絲束結(jié)合緊密。對(duì)照組少量疏松結(jié)締組織與韌帶附著，外層滑膜包繞明顯，切片見炎癥細(xì)胞減少明顯，蠶絲束表面被少量結(jié)締組織包繞，未見血管結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)。空白組韌帶表面滑膜覆蓋不明顯，切片可見少量炎性細(xì)胞，未見明顯纖維結(jié)構(gòu)。術(shù)后16W，實(shí)驗(yàn)組韌帶表面結(jié)締組織生長(zhǎng)明顯，完全包繞韌帶，表面可見微小血管生長(zhǎng)，滑膜豐富，關(guān)節(jié)內(nèi)滑液清亮，關(guān)節(jié)軟骨完好無磨損，切片見蠶絲束與致密結(jié)締組織緊密結(jié)合，纖維結(jié)締組織已長(zhǎng)入蠶絲韌帶，微型血管出現(xiàn)。對(duì)照組韌帶

7、部分被軟組織覆蓋，滑膜生長(zhǎng)旺盛，切片蠶絲束表面可見有纖維結(jié)構(gòu)附著，未發(fā)現(xiàn)明顯血管結(jié)構(gòu)?？瞻捉M韌帶表面大部分由滑膜覆蓋，切片見少量結(jié)締組織包繞蠶絲束。各組取材后均行力學(xué)檢測(cè)，記錄所得最大抗拉強(qiáng)度值，結(jié)果顯示RGD肽修飾的蠶絲韌帶復(fù)合體的抗拉強(qiáng)度明顯高于未經(jīng)修飾的蠶絲韌帶復(fù)合體以及單純蠶絲韌帶，差別存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論
　　1、RGD肽與蠶絲韌帶復(fù)合后可明顯促進(jìn)BMSCs的粘附與鋪展效率。
　　2、R

8、GD肽修飾的蠶絲人工韌帶與BMSCs形成復(fù)合體，在膝關(guān)節(jié)微環(huán)境下能夠加快移植物韌帶化的趨勢(shì)。
　　意義
　　近年來，韌帶損傷病例呈現(xiàn)增多趨勢(shì)，而相應(yīng)重建手術(shù)隨之增多。在重建材料的探索中，蠶絲被認(rèn)為是一種有前途的重建材料，近年來研究發(fā)現(xiàn)，蠶絲絲素材料擁有良好的生物相容性，突出的力學(xué)性能，而且能夠生物性降解，滿足成為人工韌帶材料的所有特性，可以作為骨科組織損傷修復(fù)的一類材料。而這種材料也存在細(xì)胞粘附不良的缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中，通過在其