寡聚噻吩及皂苷類衍生物抑制流感病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的作用及機(jī)制.pdf

1、背景:
　　甲型流感是甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)引起的急性呼吸道傳染病。在20世紀(jì)已經(jīng)爆發(fā)過4次世界范圍的甲型流感病毒大流行，其中死于1918年西班牙流感的人數(shù)多達(dá)2000～5000萬。1997年香港爆發(fā)了高致病性H5N1禽流感，截止至2015年1月6日，世界衛(wèi)生組織(WHO)報道了694例H5N1禽流感病毒感染確診病例，其中402人死亡，死亡率高達(dá)57.92％，死亡者多為青壯年。2009年新甲型H

2、1N1流感病毒造成世界范圍的流感爆發(fā)，確診病例超過130萬人，其中1.4萬人死亡，給人類健康帶來巨大威脅。2013年我國等多?。ㄊ校┌l(fā)生不明原因重癥肺炎病例，至2013年5月27日共確診人感染H7N9亞型禽流感病毒130例，其中死亡37人，死亡率接近30％。上述感染案例表明H5N1、H7N9禽流感病毒可以跨越宿主從禽類感染到人類，而現(xiàn)有疫苗卻無法預(yù)防。2012年的兩項關(guān)于H5N1獲得哺乳動物間傳播能力的研究表明，H5N1禽流感病毒的血凝

3、素蛋白僅需發(fā)生4個位點的突變，就能在哺乳動物雪貂間進(jìn)行空氣傳播。若具有高致死率的H5N1禽流感病毒突變后獲得人傳人的空氣傳播能力，將導(dǎo)致巨大的社會恐慌和更高死亡率。
　　目前市場上的靶向病毒的特異性抗流感藥物，根據(jù)作用機(jī)制可分為兩類:1）M2離子通道阻斷劑，如金剛烷胺和金剛乙胺，它們通過阻斷M2離子通道蛋白以阻止病毒脫殼。然而，大部分流感病毒株已經(jīng)對這兩個藥物耐藥。2）神經(jīng)氨酸酶抑制劑（neuraminidase inhibito

4、r，NAI），F(xiàn)DA批準(zhǔn)上市的有扎那米韋和奧司他韋（Oseltamivir，達(dá)菲），是目前抗流感一線藥物。NAI通過抑制神經(jīng)氨酸酶活性，抑制唾液酸受體的切割，導(dǎo)致子代病毒無法釋放。雖然感染H5N1禽流感的病人均采用了NAI治療，死亡率仍很高，對NAI耐藥的毒株也不斷被分離到。值得注意的是，2014年4月Tom Jefferson綜合分析Roche公司被迫公開的臨床數(shù)據(jù)及其他臨床數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)目前數(shù)據(jù)不能證實NAI類能降低流感的致死率和住院率

5、及兒童肺炎的并發(fā)率。
　　在病毒進(jìn)入抑制劑的研究上，目前采用靶向HA的假病毒篩選體系可以尋找特異性病毒入胞抑制劑。本課題組采用H5N1假病毒高通量篩選模型和分子對接等方法曾發(fā)現(xiàn)了兩類小分子化合物能特異性抑制HA2亞基，從而抑制禽流感病毒入胞。①課題組研究曾發(fā)現(xiàn)化合物CL-385319的苯環(huán)通過π-π共價與H5N1流感病毒HA2亞基靶穴中芳香環(huán)氨基酸殘基結(jié)合。針對此藥物靶穴設(shè)計的新化合物1L，其噻吩環(huán)增強(qiáng)了其苯環(huán)與HA的π-π共價結(jié)

6、合力，因而其抗H5N1病毒的活性提高，提示化合物11與HA的π-π共價結(jié)合是其抑制病毒的關(guān)鍵。②課題組基于H5N1假病毒模型還發(fā)現(xiàn)了新型皂苷系列小分子H5N1禽流感病毒進(jìn)入抑制劑，其中化合物3（熊果酸甲酯皂苷）活性最高，進(jìn)一步構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，化合物1-3結(jié)構(gòu)中的馬鈴薯三糖和苷元均為活性必要片段。
　　目的:
　　本研究以流感病毒包膜上的血凝素蛋白(hemagglutinin，HA)作為新型抗流感藥物的作用靶點，建立假病毒高

7、通量篩選模型，基于本實驗室發(fā)現(xiàn)的病毒進(jìn)入抑制劑分子骨架，合理設(shè)計小分子類流感病毒進(jìn)入抑制劑，并篩選其抑制H5N1流感病毒進(jìn)入的活性;進(jìn)一步研究活性化合物抑制H5N1流感病毒入胞的機(jī)制;針對血凝素的易突變性，對機(jī)制明確的化合物，繼續(xù)研究其是否廣譜抑制或中和H1N1甲型流感活病毒。具體化合物及篩選庫設(shè)計如下:
　　1.基于HA靶穴π-π共價結(jié)合的機(jī)制，我們設(shè)計寡聚噻吩類衍生物，推測其與誘導(dǎo)靶穴產(chǎn)生更強(qiáng)的π-π共價結(jié)合，因而活性有可能提

8、高。
　　2.基于病毒進(jìn)入抑制劑化合物3(3-o-β-馬鈴薯三糖-熊果酸甲酯皂苷)，構(gòu)效關(guān)系研究苷元替換及苷元周圍羧基的酯酰修飾或酰胺轉(zhuǎn)換;基于抑制活性對糖鏈結(jié)構(gòu)嚴(yán)格依賴，我們只將苷元上糖苷鍵連接的3-OH從β構(gòu)象改變?yōu)棣翗?gòu)象。
　　方法:
　　1.采用H5N1假病毒的篩選模型篩選小分子化合物的抑制活性:測序鑒定用于假病毒包裝的關(guān)鍵質(zhì)粒，即表達(dá)毒株A/Thailand/Kan353/2004(H5N1)血凝素靶點的HA

9、質(zhì)粒;采用PEI轉(zhuǎn)染試劑將核心質(zhì)粒pNL4.3 R-E-、流感包膜質(zhì)粒HA、NA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝H5N1流感假病毒;假病毒感染48h后，檢測宿主MDCK細(xì)胞中報告基因熒光素酶的催化發(fā)光強(qiáng)度反映病毒的進(jìn)入量。
　　2.MTT法檢測藥物的細(xì)胞毒性和病毒導(dǎo)致的細(xì)胞病變(CPE):小分子化合物作用于MDCK細(xì)胞48h后檢測藥物對細(xì)胞的毒性，采用Calccusyn軟件計算細(xì)胞半數(shù)毒性濃度;在給藥或不給藥的條件下，病毒感染MDCK細(xì)胞4

10、8h后采用MTT檢測細(xì)胞活力，采用Reed-Muench法計算藥物對病毒導(dǎo)致細(xì)胞病變的抑制活性。
　　3.針對病毒包膜蛋白的生物活性和滴度檢測:針對病毒血凝素蛋白，采用血凝滴度法檢測流感病毒或假病毒的血凝滴度，對照組采用哈爾濱獸醫(yī)研究所提供的H5抗原和相應(yīng)抗血清;針對病毒神經(jīng)氨酸酶，采用神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選試劑盒或WHO Standard Operating Procedure的實驗方法檢測神經(jīng)氨酸酶活性，培養(yǎng)上清的神經(jīng)氨酸酶活性

11、可反映其流感病毒含量。
　　4.采用假病毒體系初步判定活性化合物特異性靶向HA:包裝病毒核心相同但是包膜為VSVG的VSV假病毒，如果藥物特異性抑制H5N1流感假病毒且對VSV假病毒無效，則藥物特異作用于流感假病毒的包膜蛋白;采用神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選試劑盒檢測藥物對NA的抑制活性，若無抑制作用則可推測藥物特異性作用于HA。
　　5.觀察藥物與HA2亞基的相互作用:采用血凝抑制實驗觀察藥物抑制病毒入胞機(jī)制是否通過抑制病毒HA1

12、亞基吸附受體;采用表面等離子共振法(SPR)檢測化合物與HA蛋白及其HA2亞基的親和力。
　　6.觀察藥物對H1N1流感活病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)抑制活性和機(jī)制:雞胚擴(kuò)毒，采用Reed-Muench法計算病毒TCID50滴度;觀察在全程給藥、吸附之前藥物與病毒共孵或病毒吸附之后給藥三種模式下，藥物對H1N1流感活病毒的抑制活性;采用加藥時間點的方法觀察藥物是否作用病毒復(fù)制的早期階段;采用免疫熒光法觀察藥

13、物對病毒蛋白表達(dá)的影響。
　　7.動物實驗觀察藥物是否中和病毒，阻斷病毒對宿主的感染。
　　8.采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)的組間比較采用單因素方差分析，Levene方差齊性檢驗檢查方差齊性，方差齊的數(shù)據(jù)用LSD法進(jìn)行兩兩比較，方差不齊的數(shù)據(jù)采用Dunnett T3法進(jìn)行兩兩比較，數(shù)據(jù)用Mean±SD表示。生存率分析采用壽命表法;體重-時間曲線數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量資料的方差分析。
　　結(jié)果:
　

14、　1.基于π-π共價結(jié)合靶穴設(shè)計的寡聚噻吩類化合物、進(jìn)入抑制劑化合物3衍生的五環(huán)三帖皂苷類化合物對H5N1亞型流感病毒入胞都具有抑制作用，其抑制活性的IC50分別可達(dá)0.029～74μM，0.98～22.5μM;且細(xì)胞毒性較小，抑制H5N1流感假病毒的選擇指數(shù)分別為2.08～1169.59，3.5～162.6。
　　2.寡聚噻吩類化合物的構(gòu)效關(guān)系表明，連接碳鏈長為4的化合物其抑制H5N1假病毒活性比連接碳鏈長為3的化合物提高10-

15、100倍(3sf＞3sc，3sk＞3sh，3si＞3sg，3se＞3sb，2sd＞2sb);強(qiáng)效活性化合物(IC50＜1μM)如2sd，3sf，3si，3sk,4sc分子結(jié)構(gòu)中噻吩環(huán)的數(shù)量≥2，提示寡聚噻吩環(huán)是該系列化合物的分子骨架。
　　3.皂苷類化合物的構(gòu)效關(guān)系分析表明，苷元17-COOH的酯?；蝓０坊败赵?-OH由β位變構(gòu)為α位均明顯改善藥物毒性和選擇性。
　　4.通過假病毒模型體系初步認(rèn)定連接碳鏈長度為3的寡聚噻

16、吩類化合物（以4sc為代表）和皂苷類化合物（以化合物15為代表）特異性作用于血凝素HA，這是因為化合物4sc和化合物15對VSV假病毒進(jìn)入無抑制作用且不抑制流感病毒的NA（組間比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異，p＞0.05）。
　　5.化合物4sc和化合物15不抑制病毒吸附紅細(xì)胞所引起的血凝，提示其不抑制病毒的吸附作用，可能抑制HA2亞基的融合功能;采用分子對接證實化合物15結(jié)合于HA2亞基靶穴的酸殘基Lys-26、Asn-50、Asn-53、

17、Asp-57。
　　結(jié)論:
　　1.基于π-π共價結(jié)合靶穴設(shè)計的寡聚噻吩類化合物4sc和3-o-β-馬鈴薯三糖-熊果酸甲酯衍生的皂苷類化合物15都可特異性靶向病毒血凝素HA2亞基，從而抑制H5N1及H1N1亞型流感病毒入胞，抑制活性IC50可分別達(dá)nM級和μM級;
　　2.寡聚噻吩類化合物4sc在體外和體內(nèi)模型中均具有強(qiáng)效殺H1N1亞型流感活病毒作用，溫度和有機(jī)物對其殺病毒作用影響較小，且其細(xì)胞毒性很小，可作為特殊用途