大蒜總皂苷的抗缺氧生物活性作用及機(jī)制研究.pdf

1、缺氧是相當(dāng)常見(jiàn)的病理過(guò)程。在高原環(huán)境下，機(jī)體可發(fā)生高原低氧，可導(dǎo)致急、慢性高原??；在呼吸、血液、循環(huán)等系統(tǒng)疾病時(shí)，由于氧供給和/或氧利用障礙，也可引發(fā)機(jī)體缺氧反應(yīng)，使疾病加重；此外，機(jī)體疲勞、特殊作業(yè)如深海潛水和航天等其他許多情況均可發(fā)生缺氧。積極采取措施預(yù)防和治療機(jī)體缺氧，對(duì)包括高原病在內(nèi)的諸多疾病的防治有舉足輕重的作用。目前，抗缺氧保健品和藥物非常缺乏，由于防治效果或經(jīng)濟(jì)成本等原因，適宜推廣應(yīng)用的產(chǎn)品則更少。因此，研究與開(kāi)發(fā)高效、經(jīng)

2、濟(jì)、低毒的抗缺氧產(chǎn)品具有十分重要的意義。 大蒜在全世界普遍種植，是藥食同源植物，在人們?nèi)粘Ｉ攀持芯哂兄匾匚唬谧鎳?guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中也早有利用。大量實(shí)驗(yàn)證明，大蒜不但有抗菌、消炎、殺蟲等作用，也有降血脂、降血壓、抗風(fēng)濕、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力和抗氧化等多種重要生理功效。目前認(rèn)為大蒜的活性成分主要是含硫有機(jī)化合物和皂苷類。相關(guān)面市產(chǎn)品主要是一些大蒜粗制品和少量以含硫有機(jī)化合物為有效成分的產(chǎn)品，大蒜制品尤其是深加工產(chǎn)品具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力。

3、 本文首先驗(yàn)證了蒜粉及提取物抗小鼠常壓密閉缺氧的生物活性，然后篩選出大蒜總皂苷(Garlic saporlins，GSP)為大蒜抗缺氧活性成分。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，GSP具有明顯抗缺氧作用：(1)可以延長(zhǎng)密閉缺氧小鼠的生存時(shí)間，有抗常壓缺氧的作用；(2)可以顯著延長(zhǎng)亞硝酸鈉中毒小鼠的存活時(shí)間，有保護(hù)亞硝酸鈉中毒性缺氧損傷的作用；(3)可以延長(zhǎng)小鼠斷頭后張口呼吸時(shí)間，對(duì)腦急性缺血性缺氧有一定保護(hù)作用；(4)可以增加急性低壓性缺氧小鼠大腦

4、、心肌和肝臟組織的總抗氧化能力，增加大腦組織抗氧化酶CAT及肝臟組織SOD活性，降低肝臟MDA和大腦蛋白質(zhì)羰基含量，具有抗急性低壓性缺氧和氧化損傷的作用，同時(shí)提示GSP的抗氧化作用可能是其抗缺氧的重要機(jī)制。 目前研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激是許多關(guān)鍵生物學(xué)問(wèn)題產(chǎn)生的中心環(huán)節(jié)。嚴(yán)重缺氧時(shí)，大量活性氧(ROS)和活性氮族(RNS)產(chǎn)生，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激增強(qiáng)，蛋白質(zhì)、核甘酸和脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和功能障礙。為進(jìn)一步證明GSP的抗

5、缺氧作用和分子機(jī)制，以PC12細(xì)胞為對(duì)象進(jìn)行研究，并從GSP對(duì)細(xì)胞氧化損傷的影響方面探索其抗缺氧機(jī)制。結(jié)果表明： (1)一定劑量的GSP對(duì)dPC12(Differentiated PC12)細(xì)胞有明顯的缺氧保護(hù)作用，可減少缺氧對(duì)細(xì)胞的毒性作用、保護(hù)細(xì)胞活力和維持細(xì)胞分化狀態(tài)，上調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)記蛋白TUJ-1的表達(dá)。 (2)GSP對(duì)缺氧誘導(dǎo)的dPC12細(xì)胞氧化損傷有顯著的保護(hù)作用。 ①GSP可以顯著減少使dPC1

6、2細(xì)胞缺氧時(shí)MDA和8-OH-dG產(chǎn)物； ②GSP可上調(diào)缺氧時(shí)dPC12的SOD2和CAT的酶活性、mRNA及蛋白表達(dá)，其中對(duì)CAT的調(diào)節(jié)作用尤其顯著； ③GSP可以顯著減少缺氧導(dǎo)致的p65核轉(zhuǎn)位。 結(jié)果提示，GSP對(duì)dPC12細(xì)胞有顯著的缺氧保護(hù)和抗氧化損傷作用，而GSP的抗氧化損傷作用可能是其抗缺氧的重要機(jī)制。GSP對(duì)SOD2、尤其是對(duì)CAT的基因表達(dá)和活性的上調(diào)，以及對(duì)NF-κB(nuclear facto

7、r-kappa B)核轉(zhuǎn)位的抑制作用，可能是其抗氧化損傷作用的重要途徑。 為制備GSP，本課題建立了大蒜總皂苷的提取純化工藝和含量測(cè)定方法。(1)大蒜總皂苷的提取工藝：70％乙醇浸提物經(jīng)石油醚脫脂，乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，最后經(jīng)D101大孔樹(shù)脂純化處理。其中，運(yùn)用正交設(shè)計(jì)優(yōu)選出醇提條件：70％乙醇(用量3L/kg)、浸泡72 h、提取1次。含量測(cè)定和TLC等分析表明，該工藝可以提取純度較高的大蒜總皂苷。(2)GSP含量測(cè)定方法

8、：以薯蕷皂苷元為對(duì)照品，香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法在532nm測(cè)定大蒜提取物中總皂苷含量。試驗(yàn)表明該測(cè)定方法精密度和重復(fù)性良好，平均加樣回收率達(dá)97.8％(RSD=1.98％)，準(zhǔn)確度較高。用該方法測(cè)定大蒜總皂苷含量，可以作為評(píng)價(jià)總皂：苷的提取效率，作為實(shí)驗(yàn)中控制總皂苷質(zhì)量的可行手段。 本課題首先驗(yàn)證了蒜粉及蒜粉的水和乙醇提取物具有抗常壓密閉缺氧的作用，然后篩選出GSP為其重要的抗缺氧活性成分。細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證明，GSP具有