龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中內(nèi)源誘捕靶標(biāo)(eTM) 調(diào)控miRNA的應(yīng)用研究.pdf

1、龍眼（Dimocarpus longan Lour.）又名桂圓。常綠喬木。其胚胎發(fā)育狀況影響著果實(shí)的產(chǎn)量及品質(zhì)。植物胚胎的發(fā)育是一個(gè)細(xì)胞分化的過(guò)程，該過(guò)程中必然存在眾多調(diào)控因子的作用。而microRNA(miRNA)和內(nèi)源誘捕靶標(biāo)（eTM）作為一類新型調(diào)控因子在植物胚胎的細(xì)胞分化和發(fā)育過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。植物體胚與活體胚胎在形態(tài)和分子水平上具有相似性，是研究植物胚胎發(fā)育的理想實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。eTM依靠它的特殊結(jié)構(gòu)，通過(guò)與目標(biāo)miRNA的

2、互補(bǔ)，抑制miRNA的表達(dá)。本試驗(yàn)對(duì)在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中的miRNA與對(duì)應(yīng)的eTM研究，分析它們具體對(duì)應(yīng)關(guān)系，研究miRNA及eTM對(duì)龍眼體胚發(fā)生的作用，為龍眼優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品生產(chǎn)提供參考依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的龍眼體胚內(nèi)源eTMs的預(yù)測(cè)與生物信息學(xué)分析。根據(jù)eTM與miRNA互補(bǔ)結(jié)構(gòu)中均帶有3個(gè)核苷酸的環(huán)狀凸起的特殊結(jié)構(gòu)，選取龍眼30個(gè)miRNA為研究對(duì)象，以龍眼轉(zhuǎn)錄組為eTM預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)，最終預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)選取的30

3、個(gè)miRNA共對(duì)應(yīng)有155潛在的eTMs。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這些miRNA和eTM存在以下對(duì)應(yīng)關(guān)系：1個(gè)eTM調(diào)控1個(gè)miRNA表達(dá)，也可能是1個(gè)eTM同時(shí)調(diào)控多個(gè)miRNA或者多個(gè)eTM同時(shí)調(diào)控1個(gè)miRNA。并在NCBI， Nr， Swissprot，KEGG，GO數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)預(yù)測(cè)得出的eTM進(jìn)行功能注釋。結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的大部分eTM為未知蛋白；其次為各種酶類，如RNA聚合酶、加工酶、激酶、轉(zhuǎn)移酶、解旋酶、連接酶、水解酶、核糖核酸酶和加氧

4、酶；此外，還包括一些次生代謝合成相關(guān)酶類等。
　　2.eTM和對(duì)應(yīng)miRNA在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)分析。eTM-miRNA配對(duì)保留的目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物，以被其互補(bǔ)的miRNA切割，導(dǎo)致目標(biāo)mRNA的表達(dá)水平增加。根據(jù)所預(yù)測(cè)并篩選的45個(gè)eTMs和相對(duì)應(yīng)的30個(gè)miRNAs進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析試驗(yàn)。通過(guò)分析eTM與miRNA在龍眼胚性愈傷組織（EC）、不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)(ICpEC)和球形胚（GE）中的表達(dá)水平的變化趨勢(shì)

5、：EC到ICpEC的發(fā)育階段過(guò)程中eTM1866與miR159a.1、eTM20206與miR164a、eTM3727與miR319b、eTM3727與miR166c*、eTM8169與miR172a、eTM19726與miR398a、eTM1255與miR413、eTM23730與miR416、eTM5958與miR419表達(dá)量呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)。在ICpEC到GE的發(fā)育階段過(guò)程中eTM1866與miR159a.1、eTM20206與

6、miR164a、eTM19726與 miR398a、eTM29075與 miR398b1、eTM19658和eTM22892與miR400、eTM23730與miR416表達(dá)量呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，其余的19個(gè)miRNA與29個(gè)eTMs在龍眼EC、ICpEC和GE中沒(méi)有呈現(xiàn)出負(fù)調(diào)控關(guān)系。說(shuō)明eTM在對(duì)miRNA的表達(dá)上起到重要調(diào)控作用，提示起在龍眼種子(胚胎)發(fā)育的調(diào)控中發(fā)揮作用。
　　3.eTM和相對(duì)應(yīng)miRNA在不同激素處理下龍眼

7、胚性愈傷組織實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)分析。在上述基礎(chǔ)上，根據(jù)篩選出在龍眼EC、ICpEC、GE三個(gè)發(fā)育階段呈現(xiàn)出具有負(fù)相關(guān)趨勢(shì)的9個(gè)miRNA與對(duì)應(yīng)的16個(gè)eTM，以不同激素濃度處理下的龍眼胚性愈傷組織為cDNA為模板中進(jìn)行進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析發(fā)現(xiàn)：龍眼愈傷組織在受到外源激素KT處理時(shí)，在KT的濃度遞增下， miR419與 eTM5958, miR164與 eTM20206, miR159a1與 eTM1866, miR166c*與eTM

8、3727, miR398a與eTM19726的相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)在部分濃度變化中存在負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。龍眼愈傷組織在受到外源激素2,4-D處理時(shí)，在2,4-D濃度遞增的情況下，miR164與eTM20206，miR172a與eTM1869，miR400與eTM19658，miR159a1與eTM1866，miR166c*與eTM3727, miR398a與eTM19726的相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)在部分濃度變化中存在負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。龍眼愈傷組織在受到外源激素N

9、PA處理時(shí)，在NPA濃度遞增的情況下，miR164與eTM20206，miR400與eTM19658，miR166c*與eTM3727的相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)在部分濃度變化中存在負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。
　　研究結(jié)果表明：在龍眼的生產(chǎn)過(guò)程中，可以通過(guò)一定濃度的KT，NPA，2,4-D激素，對(duì)龍眼體胚在生長(zhǎng)過(guò)程中的miRNA與eTM的表達(dá)情況產(chǎn)生影響，使miRNA與eTM在這一時(shí)期功能受到影響。結(jié)合所運(yùn)用的KT和生長(zhǎng)素在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用，通過(guò)分析m

10、iRNA與eTM在不同激素濃度處理后的響應(yīng)情況，將為調(diào)控龍眼胎的發(fā)育奠定基礎(chǔ)。
　　4.龍眼潛在eTM與對(duì)應(yīng)miRNA的負(fù)調(diào)控關(guān)系驗(yàn)證。miRNA沉默是一種將人工合成的寡核苷酸小分子miRNA通過(guò)導(dǎo)入細(xì)胞。內(nèi)使其與細(xì)胞內(nèi)源性miRNA結(jié)合成異源雙鏈，從而降低抑制miRNA的作用。這種人工合成的寡核苷酸小分子的技術(shù)是對(duì)miRNA的功能研究中常用的方法。本試驗(yàn)通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑介導(dǎo)miR398a、miR164a模擬體轉(zhuǎn)入龍眼胚性愈

11、傷組織。試驗(yàn)分析證實(shí)eTM19726與miR398a、eTM20206與miR164a具有負(fù)調(diào)控作用。在miR398a與miR164a的表達(dá)水平升高情況下， eTM19726與 eTM20206的表達(dá)水平隨之下降。而在 miR398a與miR164a的表達(dá)水平降低的情況下，eTM19726與eTM20206的表達(dá)水平隨之升高。說(shuō)明eTM19726與eTM20206分別對(duì)miR398a與miR164a存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。該研究結(jié)果為進(jìn)一步將e