龍眼體胚發(fā)生過程中與ARF相關(guān)小分子RNA的功能研究.pdf

1、植物生長素通過調(diào)控干細(xì)胞的再生而誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生。同時，位于生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中心的生長素響應(yīng)因子受小分子RNA的調(diào)控。本研究以龍眼體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中不同發(fā)育階段的胚性培養(yǎng)物為試驗材料，通過RT-PCR和RACE技術(shù)克隆小分子RNA及其靶基因生長素響應(yīng)基因子ARFs，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析；在此基礎(chǔ)上，采用RLM-RACE法鑒定靶基因TAS3、ARF3、ARF4、ARF6、ARF8、ARF10、ARF16、ARF17的裂解位點；通過實

2、時熒光定量技術(shù)檢測龍眼體胚發(fā)生過程中小分子RNA及其靶基因ARFs的表達(dá)情況并對其調(diào)控機制做進(jìn)一步分析。為驗證miR390、TAS3和ARFs三者之間的互作關(guān)系，進(jìn)一步通過遺傳轉(zhuǎn)化將龍眼TAS3基因在Micro-Tom番茄中過表達(dá)，觀察再生植株的表型變化并檢測miR390、ARF3和ARF4在轉(zhuǎn)基因番茄中的表達(dá)情況。本研究主要結(jié)果如下：
　　1龍眼體胚miR160、miR167、miR390與TAS3初級體克隆及生物信息學(xué)分析

3、r>　　以龍眼“紅核子”不同胚性培養(yǎng)物為材料，采用RT-PCR技術(shù)法克隆獲得了龍眼miR160、miR167、miR390、TAS3初級體序列，分別命名為dlo-pri-miR160、dlo-pri-miR167、dlo-pri-miR390、dlo-pri-TAS3，其大小分別為441 bp、185 bp、785 bp、579 bp。生物信息學(xué)分析表明，dlo-pri-miR160、dlo-pri-miR167、dlo-pri-miR

4、390、dlo-pri-TAS3均含有典型的二級結(jié)構(gòu)，且自由能比一般植物的平均自由能都較高；系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，龍眼miR160、miR167、TAS3初級體分別與番茄（ Solanum lycopersicum）、柑桔（ Citrus sinensis）、番茄（ Solanum lycopersicum）的親緣關(guān)系較近，龍眼miR390與擬南芥（Arabidopsis thaliana）、葡萄（Vitis vinifera）、大豆（Gly

5、cine max）等其他物種的親緣關(guān)系都較遠(yuǎn)。
　　2龍眼胚性愈傷組織靶基因ARFs的克隆及生物信息學(xué)分析
　　以龍眼“紅核子”胚性愈傷組織為材料，通過RT-PCR結(jié)合RACE法對sRNA調(diào)控的靶基因生長素響應(yīng)基因家族成員進(jìn)行克隆。成功獲得ARF3（KJ200347.1）、ARF4（KJ461667.1）、ARF6（KJ410230）、ARF8（KJ410232）、ARF10（KJ410234）、ARF16（KJ410235

6、）、ARF17（KJ410236）cDNA序列，其大小分別為2561 bp、2698 bp、3381 bp、2868 bp、2093 bp、2279 bp、2098 bp。生物信息學(xué)分析表明：在龍眼生長素響應(yīng)蛋白中，D1ARF3、D1ARF6、D1ARF8、D1ARF10、D1ARF16和D1ARF17都屬于水溶性蛋白；其中D1ARF6蛋白、D1ARF8蛋白、D1ARF10蛋白、D1ARF16蛋白都具有B3-DNA結(jié)合區(qū)、ARF家族的保

7、守區(qū)Auxin-resp和IAA-ARF-dimerisation3種結(jié)構(gòu)域，而 DlARF3蛋白和DlARF17蛋白只具有B3-DNA結(jié)合區(qū)和ARF家族的保守區(qū)Auxin-resp兩種結(jié)構(gòu)域；龍眼生長素響應(yīng)蛋白ARF6、ARF8中間區(qū)域富含谷氨酰胺、絲氨酸和亮氨酸，龍眼生長素響應(yīng)蛋白ARF3、ARF10、ARF16、ARF17中間非保守區(qū)域都不富含谷氨酸（Glu），都具有抑制轉(zhuǎn)錄活性；同源性分析表明，龍眼生長素響應(yīng)基因家族成員都分別與

8、擬南芥生長素響應(yīng)基因家族成員有很接近的親緣關(guān)系。
　　3龍眼生長素響應(yīng)因子ARFs及TAS3基因的裂解位點驗證
　　為進(jìn)一步驗證龍眼體胚中sRNA與ARFs的調(diào)控關(guān)系，以龍眼“紅核子”松散型胚性愈傷組織、球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉形胚5個不同發(fā)育階段胚性培養(yǎng)物的混樣cDNA為模板，采用改良的RLM-RACE法驗證靶基因的裂解位點。經(jīng)測序結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)miR390靶標(biāo)的TAS3前體在TTA/TCC位點被切割；而TAS3識別

9、ARF3和ARF4的第二個切割位點，分別為GCA/AGG、CAA/GTT；在ARF6所挑取的18個單克隆子中所裂解的位置都位于龍眼miR167識別位點以外的序列中；而ARF8所挑取的25個單克隆子中只有GCU/GGC這個切割位點位于miR167識別位點序列中；分別挑取miR160的靶基因生長素響應(yīng)因子ARF10、ARF16、ARF17單克隆子，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)它們有共同的裂解位點為AGG/GAG。
　　4龍眼體胚發(fā)生過程中小分子RNA及

10、其靶基因ARFs的定量表達(dá)分析
　　采用qPCR技術(shù)，分別以龍眼“紅核子”品種體胚不同發(fā)育階段培養(yǎng)物、龍眼“四季蜜”品種不同組織器官、2,4-D處理下的龍眼胚性愈傷組織為材料，檢測龍眼體胚miR160、miR167、miR390與TAS3初級體及其靶基因ARFs的mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。結(jié)果表明：在龍眼體胚發(fā)育的5個不同階段中，miR160初級體在球形胚時期的轉(zhuǎn)錄水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其靶基因ARF10、ARF16、ARF17的轉(zhuǎn)錄水平，這可

11、能與miR160參與球形胚的形態(tài)建成以及對靶基因的負(fù)調(diào)控有關(guān)；但檢測不到龍眼miR167初級體的表達(dá)信號，其靶基因ARF6與ARF8的表達(dá)變化趨勢完全相反；龍眼pri-miR390與TAS3初級體在球形胚時期的表達(dá)差異較顯著；而TAS3初級體與其靶基因ARF4的表達(dá)模式較接近的，ARF3的整體轉(zhuǎn)錄水平波動較平穩(wěn)且表達(dá)量較低。在龍眼“四季蜜”中，dlo-pri-miR160及其靶基因表達(dá)差異較顯著的組織器官是種子、根；龍眼pri-miR3

12、90、pri-TAS3、ARF3、ARF4在9個組織器官中都有表達(dá)，且都在根部中有最高的表達(dá)量；雖然檢測不到龍眼miR167初級體的表達(dá)信號，但其靶基因生長素響應(yīng)因子ARF6、ARF8在花蕾、根中都有較高的轉(zhuǎn)錄水平。在2,4-D處理下的龍眼胚性愈傷組織中，ARF10的表達(dá)量明顯較高且整體轉(zhuǎn)錄水平呈上升的趨勢，dlo-pri-miR160與ARF16、ARF17的表達(dá)量較低且差異并不顯著；dlo-pri-miR167依然沒有表達(dá)信號，其靶

13、基因ARF6、ARF8隨著生長素濃度的增加而升高，兩者在0.5 mg/L時的表達(dá)差異較顯著；dlo-pri-miR390的整體轉(zhuǎn)錄水平略低且變化平穩(wěn)，TAS3初級體在1.0 mg/L、2.0 mg/L時的轉(zhuǎn)錄水平較高，其靶基因ARF3、ARF4在1.0 mg/L處的表達(dá)量最高，同時在2.0 mg/L時表達(dá)驟然降低。
　　5龍眼TAS3基因轉(zhuǎn)化Micro-Tom番茄及功能驗證
　　本試驗利用酶切連接法將TAS3基因片段構(gòu)建到植

14、物表達(dá)載體pCAMBIA-1301上，并將其轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105的感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行Micro-Tom番茄的遺傳轉(zhuǎn)化。為驗證轉(zhuǎn)化結(jié)果對其進(jìn)行PCR檢測，試驗結(jié)果顯示，龍眼TAS3基因已成功轉(zhuǎn)入到Micro-Tom番茄中；與對照組的普通Micro-Tom番茄相比，所獲得轉(zhuǎn)基因番茄植株的表型存在明顯差異，主要表現(xiàn)在植株葉片的異常卷曲以及莖干和根部的粗壯。利用qPCR技術(shù)檢測miR390、ARF3和ARF4在轉(zhuǎn)基因番茄植株中的表達(dá)情況，結(jié)

15、果表明：生長素響應(yīng)基因ARF3、ARF4在轉(zhuǎn)基因番茄中的表達(dá)水平都明顯低于對照水平，推測轉(zhuǎn)基因番茄植株中因TAS3基因的過量表達(dá)而強烈抑制了生長素響應(yīng)因子的表達(dá)，與預(yù)期結(jié)果一致。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)龍眼TAS3基因?qū)χ参锏母⑶o、葉的生長發(fā)育有著重要的影響。
　　綜上所述，龍眼小分子RNA準(zhǔn)確地裂解其靶基因生長素響應(yīng)因子而影響體胚的生長發(fā)育，即龍眼miR160負(fù)調(diào)控ARF10、ARF16、ARF17，miR167負(fù)調(diào)控ARF6、AR

16、F8，miR390負(fù)調(diào)控TAS3，TAS3負(fù)調(diào)控ARF3、ARF4。除龍眼miR167初級體檢測不到信號表達(dá)外，龍眼小分子RNA及其靶基因在龍眼“四季蜜”的花蕾、成花、葉片、小果、大果、果肉、果皮、種子和根9個不同組織器官中都有表達(dá)，且都在根部中有較高的轉(zhuǎn)錄水平。經(jīng)PCR試驗鑒定，在micro-Tom番茄中過表達(dá)龍眼TAS3基因并成功獲得轉(zhuǎn)基因植株，其根、莖、葉都發(fā)生明顯的變化。因此，在龍眼體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中，小分子RNA與其靶基因生