龍眼體胚成熟過程的蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、本研究以龍眼(Dimocarpus longan Lour.cv.Honghezi)“紅核子”胚性愈傷組織(Em-bryogenic callus，EC)經(jīng)過體胚發(fā)生同步化調(diào)控得到的龍眼LC2玻璃化子葉胚為材料，進行如下研究：①不同濃度的蔗糖和聚乙二醇對龍眼子葉胚成熟的影響；②龍眼子葉胚正常成熟過程的蛋白質(zhì)雙向電泳分析；③龍眼體胚成熟過程相關(guān)蛋白的質(zhì)譜鑒定及其功能分析。主要研究結(jié)果如下： 1.不同濃度的蔗糖和聚乙二醇處理的龍眼子

2、葉胚成熟效果 在初始狀態(tài)的早期玻璃化子葉形體胚體積、重量一致的情況下，龍眼體胚經(jīng)歷正常的高糖成熟體胚增大明顯，鮮重增加量是所有成熟處理中最大的，體胚堅實呈乳白色；低糖培養(yǎng)基上龍眼子葉形體胚增重最少，但是增大效果明顯，體胚較為堅實，黃褐色，少數(shù)嚴重褐變；體胚在添加7.5％的聚乙二醇和20 g·L-1的蔗糖的MS培養(yǎng)基中成熟增重增大明顯，可以比較明顯的抑制體胚褐化，但是色澤方面未達到在高糖成熟條件下的乳白色的半透明狀態(tài)，但是成熟效果

3、好于其它濃度的PEG+MS培養(yǎng)基(0％、2.5％、5.0％和10.0％)?？傊咛钦３墒煨Ч罴?，添加7.5％的聚乙二醇的MS成熟培養(yǎng)效果次之，其它濃度的PEG+MS培養(yǎng)基成熟效果較差，低糖且沒有附加PEG的培養(yǎng)效果最差。 2.龍眼體胚正常成熟過程中總蛋白點數(shù)目變化 使用線性IPG膠條(pH4-7)在Ettan IPGphorⅢ(GE Healthcare)進行第一向等電聚焦，第二向SDS-PAGE采用SE600 R

4、ube標準垂直電泳系統(tǒng)(GE Healthcare)，銀染法染色后凝膠采用Imagine ScannerⅢ(GE Healthcare)掃描儀采集圖像，在Image Master2D Platinum6.0軟件(GE.Healthcare)做圖像分析。結(jié)果表明：龍眼體胚成熟過程中總蛋白點數(shù)目變化趨勢為先稍稍下降，又迅速升高，30 d升高至最高點，然后經(jīng)歷一個迅速降低的過程，并且蛋白點數(shù)目降低至最低值，然后體胚細胞中蛋白點總數(shù)先是幾乎沒有

5、變化，后較為迅速升高，即體胚成熟培養(yǎng)的15 d-30 d期間，龍眼子葉形體胚蛋白點數(shù)目變化最為劇烈，經(jīng)歷了先迅速升高后迅速降低的過程。 3.龍眼體胚正常成熟過程中總蛋白點等電點(pI)變化 pI值在4-5范圍內(nèi)的蛋白點比例變化呈現(xiàn)先上升再下降趨勢，然后保持幾乎保持穩(wěn)定；而pI值在6-7范圍內(nèi)的蛋白點所占比例先是緩慢升高，后較為迅速的升高，然后較為快速的降低，然后再升高最后在體胚成熟末期又降低，總的變化趨勢類似“M”狀；

6、在龍眼子葉形體胚成熟晚期(75 d)此等電點的蛋白比例升至最高水平；pI值在5-6范圍內(nèi)的蛋白點比例經(jīng)歷先降低，后緩慢升高，然后在高糖成熟培養(yǎng)的30 d后開始迅速升高，在45 d達到最高點，此后又降低，然后升高，總的變化趨勢類似“W”。 4.龍眼體胚正常成熟過程中總蛋白點分子量(MW)變化 龍眼早期玻璃化體細胞胚胎經(jīng)歷正常高糖成熟過程中，不同分子量的蛋白點變化總體趨勢基本類似，呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢，峰值都位于30

7、 d；分子量(MW)30 KD-45 KD的蛋白點比例在每個階段都是最高的，居于第二位是分子量45 KD-60 KD范圍內(nèi)的蛋白點，居于第三位的是分子量20.1KD-30KD范圍內(nèi)的蛋白點，居于倒數(shù)第二位的是MW范圍在14.4 KD-20.1 KD內(nèi)的小分子量蛋白點，比例最低的類群是分子量66 KD-97 KD范圍內(nèi)的大分子量蛋白點，30 KD-45 KD、45 KD-66 KD、20.1 KD-30 KD、14.4KD-20.1 KD

8、和66 KD-97KD的蛋白點比例峰值分別出現(xiàn)在45d、15d、0d、75d和0d。 5.龍眼體胚正常成熟過程中15KD以下小分子量蛋白點數(shù)目變化 龍眼子葉形體細胞胚胎成熟過程中，小分子量蛋白數(shù)目先略有降低再大幅升高，后持續(xù)降低，至成熟胚萌發(fā)前又略有升高的趨勢，但是小分子量蛋白點比例與小分子量蛋白數(shù)目變化趨勢不同，而是呈現(xiàn)呈先略有降低再略有升高，后持續(xù)降低的趨勢，但是體胚成熟30 d時期無論小分子量蛋白數(shù)目和比例都最高(

9、35個，2.87％)，小分子量蛋白在此時積累達到頂峰。 6.龍眼體胚成熟過程相關(guān)蛋白表達變化 龍眼子葉形體細胞胚胎成熟培養(yǎng)的0 d-15 d階段，過氧化物酶(C16、C17、C19)和S-腺苷甲硫氨酸：2-去甲基萘醌甲基轉(zhuǎn)移酶(C33)顯著下調(diào)表達，磷酸丙糖異構(gòu)酶(C22)、60 s酸性核糖體蛋白(C28)、17KD-HSP(C37)和Thil蛋白鏈A(C10)顯著上調(diào)表達，15 d-30d階段，過氧化物酶C16、C17

10、、C19和烯醇酶(C20)顯著上調(diào)表達，17 KD-HSP(C37)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(C22)顯著下調(diào)表達，30 d-45 d階段，尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(C3)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(C23)、17 KD-HSP(C37)顯著上調(diào)表達，60S酸性核糖體蛋白(C28)顯著下調(diào)表達；45 d-60 d階段，烯酯酰-AC-還原酶(C18)顯著上調(diào)表達，過氧化物酶(C15)和磷酸丙糖異構(gòu)酶(C23)顯著下調(diào)表達；60d-75d階段，真核生物翻譯起始因

11、子5A(C34)顯著上調(diào)表達，尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(C3)、過氧化物酶(C16)、ACP還原酶(18)顯著下調(diào)表達。 7.龍眼體胚成熟過程中相關(guān)蛋白的功能分析 在龍眼體胚成熟過程中，質(zhì)譜鑒定的29個相關(guān)蛋白中，除24.14％功能未知的蛋白外，13.79％蛋白和蛋白質(zhì)合成相關(guān)，13.79％蛋白涉及能量和糖類代謝，20.69％蛋白涉及脅迫應答和抗氧化，3.45％涉及氨基酸代謝，3.45％蛋白涉及信號轉(zhuǎn)導，3.45％是結(jié)構(gòu)蛋白