miPEPs在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中的應(yīng)用研究.pdf

1、龍眼（Dimocarpus longan Lour.），是我國(guó)南亞熱帶地區(qū)名貴果樹(shù)。龍眼果核大小、坐果率、果實(shí)品質(zhì)及產(chǎn)量等決定于其胚胎發(fā)育狀況的優(yōu)良與否。龍眼體細(xì)胞胚胎發(fā)生系統(tǒng)可作為其重要的替代模式系統(tǒng)解決龍眼早期胚胎在遺傳上的高度雜合問(wèn)題。目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，由mRNA編碼的植物多肽作為一種新型肥料，能明顯增加產(chǎn)量并提高品質(zhì)。已有研究表明由pri-miRNA編碼的miPEP對(duì)植物相關(guān)miRNA的表達(dá)和形態(tài)建成等方面均有較大影響。目前龍眼

2、中尚未有研究，本試驗(yàn)以龍眼體胚發(fā)生系統(tǒng)為基礎(chǔ)，主要研究結(jié)果如下：
　　1.龍眼pri-miRNA全長(zhǎng)序列的獲得及生物信息學(xué)分析。利用RLM-RACE技術(shù)，對(duì)16個(gè)miRNA使用GeneRACE反轉(zhuǎn)錄試劑盒，分別獲得3，UTR8條和5，UTR10條，使用SMART?RACE試劑盒分別獲得3，UTR3條和5，UTR5條；克隆獲得pri-miRNA全長(zhǎng)序列10條。通過(guò)對(duì)18個(gè)pri-miRNA確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)它們均含有不少于1個(gè)轉(zhuǎn)

3、錄起始位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)數(shù)量存在差異。對(duì)18個(gè)pri-miRNA的啟動(dòng)子分析，發(fā)現(xiàn)它們均含有激素響應(yīng)順式作用元件，且均含有赤霉素和茉莉酸甲酯順式作用元件但種類和元件個(gè)數(shù)存在差異。
　　2.龍眼19個(gè)pre-miRNA的表達(dá)模式分析。19個(gè)pre-miRNA在龍眼EC、IcpEC、CpECGE和GE4個(gè)不同發(fā)育階段表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)：除pre-miR156-scaffold29和pre-miR156e*-scaffold3未檢測(cè)到表達(dá)

4、外，有表達(dá)的17個(gè)pre-miRNA在 IcpEC和 CpECGE表達(dá)均不高。在龍眼 EC階段中， pre-miR168a-scaffold2621、 pre-miR2118a-scaffold26、 pre-miR170-scaffold1266和pre-miR396a-scaffold38相對(duì)表達(dá)量較高。發(fā)育至IcpEC階段，17個(gè)pre-miRNA的相對(duì)表達(dá)量均不高；發(fā)育至CpECGE時(shí)，除pre-miR395a-scaffold

5、6相對(duì)表達(dá)量略高些，其他16個(gè)pre-miRNA表達(dá)量較低。發(fā)育至 GE階段， pre-miR160a-scaffold209、pre-miR390a-scaffold24、 pre-miR319a-scaffold517和 pre-miR482a-scaffold26表現(xiàn)出較高的表達(dá)量。比較19個(gè)pre-miRNA在‘紅核子’龍眼不同器官的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)19個(gè) pre-miRNA除 pre-miR156-scaffold29、pre-

6、miR156e*-scaffold38和 pre-miR398b-scaffold58未檢測(cè)出外，有表達(dá)的pre-miRNA多數(shù)多花的生長(zhǎng)發(fā)育具有較大的調(diào)控作用，在其他器官中不同pre-miRNA存在差異。對(duì)18個(gè)pri-miRNA啟動(dòng)子中均有激素順式作用元件，有響應(yīng)的各pre-miRNA效果存在差異。分別用0.5 mg/L2,4-D、2.0 mg/L赤霉素、1.0 mg/L吲哚乙酸、25μmol/L水楊酸、10μmol/L脫落酸和25

7、μmol/L茉莉酸甲酯對(duì)龍眼愈傷組織處理24 h后發(fā)現(xiàn)：pre-miR319-scaffold517在生長(zhǎng)素2,4-D、吲哚乙酸和赤霉素處理下，其相對(duì)表達(dá)量均有明顯促進(jìn)作用。pre-miR168a-scaffold2621在生長(zhǎng)素2,4-D和吲哚乙酸處理中表達(dá)量具明顯促進(jìn)作用。生長(zhǎng)素2,4-D處理對(duì)pre-miR482a-scaffold26則表現(xiàn)出明顯的抑制效果。吲哚乙酸處理下，對(duì) pre-miR168a-scaffold2621、p

8、re-miR170-scaffold1266和 pre-miR319-scaffold517的表達(dá)有促進(jìn)效果。在水楊酸處理下， pre-miR398b-scaffold58表達(dá)量受抑制。在赤霉素處理下，對(duì)pre-miR160-scaffold209和pre-miR171f-scaffold537的表達(dá)具有極顯著的抑制表達(dá)效果，而對(duì) pre-miR319-scaffold517、pre-miR394a-scaffold3884、pre-m

9、iR395a-scaffold6和pre-miR396a-scaffold38則促進(jìn)效果極明顯。在茉莉酸甲酯處理中，pre-miR395a-scaffold6的表達(dá)抑制效果明顯。
　　3.miPEP在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中的研究。采用15μmol/L由 pri-miR319不同轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)編碼的miPEP319-1、miPEP319-2和miPEP319-3連續(xù)處理龍眼愈傷組織處理3 d，結(jié)果顯示： miPEP319-2對(duì)龍眼miR3

10、19家族的3個(gè)成員表達(dá)量均有明顯的抑制效果，miPEP319-1和miPEP319-3影響較小。探究不同濃度miPEP319-2對(duì)龍眼體胚中miR319家族成員表達(dá)影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.4μmol/L miPEP319-2對(duì)miR319家族成員表達(dá)均有促進(jìn)作用，且對(duì)miR319c促進(jìn)效果最明顯。探究處理時(shí)間對(duì)miR319家族成員表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在24 h內(nèi)，不同時(shí)間對(duì)miR319家族中成員表達(dá)量有促進(jìn)效果，但促進(jìn)效果較緩慢。探究不同氨

11、基酸序列對(duì)miR319家族表達(dá)影響，發(fā)現(xiàn)0.4μmol/L miPEP319-2和miPEP319-2這兩種均能促進(jìn)miR319家族的不同成員的表達(dá)，但促進(jìn)的程度存在差異。
　　4.miPEP319在龍眼體胚發(fā)生中的應(yīng)用研究。選取具有多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)且對(duì)植物的形態(tài)建成以及抗逆性均有較大的影響的miR319，探究pri-miR319編碼的miPEP319對(duì)龍眼懸浮培養(yǎng)周期內(nèi)的應(yīng)用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在龍眼體胚發(fā)生早期，miPEP319-2和

12、scrambled miPEP319-2處理對(duì)miR319c的作用效果更明顯，同時(shí)抑制龍眼 pre-miR319a-scaffold517、 pre-miR319a-scaffold1667和pre-miR319a-scaffold1709的表達(dá)。miPEP319-2對(duì)Dlo_022819_TCP4和 Dlo_025379-GMMY的表達(dá)具有抑制表達(dá)的效果，而對(duì)Dlo_020213_TCP4、Dlo_026743_TCP4和 Dlo_0

13、21198.2-GMMYB3個(gè)靶標(biāo)的表達(dá)卻能促進(jìn)表達(dá)。scrambled miPEP319-2除對(duì)Dlo_020213_TCP4有促進(jìn)效果外，對(duì)其他4個(gè)靶標(biāo)的表達(dá)均為抑制作用。形態(tài)上發(fā)現(xiàn)用scrambled miPEP319-2和miPEP319-2處理，龍眼細(xì)胞團(tuán)顆粒變大，且顏色變深，顯微觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞排列更緊密，細(xì)胞大小不均勻。
　　龍眼pri-miR319不同轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)編碼的miPEP對(duì)龍眼體胚發(fā)生的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：miPE

14、P319-2和miPEP319-3對(duì)龍眼miR319家族成員、pre-miR319以及靶標(biāo)作用效果相似，miPEP319-1與這二者之間作用效果存在差異：miPEP319-1促進(jìn)miR319家族3個(gè)成員的表達(dá)；抑制 pre-miR319a-scaffold213、 pre-miR319a-scaffold517、pre-miR319a-scaffold1667和pre-miR319a-scaffold1709的表達(dá)；促進(jìn)靶標(biāo)Dlo_02