肝源性Hepcidin在膿毒癥發(fā)生發(fā)呢中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分肝源性hepcidin基因沉默小鼠模型的建立
　　研究目的:陽離子抗菌肽hepcidin是一種主要由肝臟合成分泌的小分子多肽。除了具有微弱的殺菌作用外，hepcidin亦是機體唯一的鐵調素，主要參與鐵穩(wěn)態(tài)的調節(jié)。研究表明，膿毒癥病人血清和尿液hepcidin的水平較對照組明顯升高。因而推測hepcidin可能在膿毒癥的感染和免疫炎癥調節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。因此，本部分研究擬采用尾靜脈高動力大劑量注射hepcidin特異性干

2、擾腺病毒的方法構建肝源性hepcidin基因沉默小鼠模型，為進一步分析肝源性hepcidin在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎。
　　研究方法:采用尾靜脈高動力大劑量注射的方法，給予balb/c雄性小鼠注射針對小鼠hepcidin基因(hepc1)的特異性shRNA重組腺病毒載體(Ad-shHepc1)，對肝臟hepcidin進行基因沉默。對照組采用同樣的方法給予對照重組腺病毒(Ad-shNeg)。于注射后13天，取小鼠的外周血、肝

3、、脾、肺和腎臟等進行檢測。采用定量PCR方法檢測外周血白細胞、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織hepcidin的mRNA表達水平。采用免疫組織化學的方法檢測肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織hepcidin的蛋白表達水平。采用普魯士藍染色的方法檢測脾臟鐵含量。同時，采用原子吸收光譜法測定小鼠血清濃度，酸消化法檢測脾臟和肝臟組織的非血紅素鐵含量。
　　結果:與注射對照重組腺病毒(Ad-shNeg)的小鼠相比較，尾靜脈高動力大劑量注射hepcidi

4、n特異性shRNA重組腺病毒載體（Ad-shHepc1）的小鼠13天后，肝臟hepcidin的mRNA水平和蛋白水平明顯降低。其他組織臟器如白細胞、脾臟、肺臟和腎臟，hepcidin表達水平無明顯變化。注射Ad-shHepc1的小鼠，脾臟巨噬細胞鐵含量較對照組明顯降低，血清鐵含量較對照組明顯升高。然而，兩組肝臟鐵含量無明顯統(tǒng)計學差異。
　　結論:尾靜脈高動力大劑量注射hepcidin特異性shRNA重組腺病毒載體(Ad-shHep

5、c1)，能夠有效抑制肝臟hepcidin表達，降低脾臟鐵含量，增加血清鐵水平，成功構建了肝源性hepcidin基因沉默(hepcidin knockdown)小鼠模型。
　　第二部分肝源性hepcidin對膿毒癥發(fā)生發(fā)展的影響
　　研究目的:Hepcidin是一種主要由肝臟合成分泌的，β-defensin樣的陽離子抗菌肽，具有廣泛的生物學活性。大量研究表明，炎癥等刺激能夠誘導肝源性hepcidin的表達上調。前期研究顯示，危

6、重病患者血漿IL-6的水平與hepcidin的含量密切相關。臨床研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥病人血清和尿液hepcidin的水平明顯升高。鑒于肝源性Hepcidin knockdown小鼠模型的成功建立，因此本部分研究主要探討肝源性hepcidin對膿毒癥發(fā)生發(fā)展的影響。
　　研究方法:采用盲腸結扎穿孔術(CLP)對肝源性hepcidin knockdown(Ad-shHepc1)小鼠和對照組(Ad-shNeg)小鼠進行膿毒癥模型的復制，觀察

7、兩組小鼠膿毒癥的7天生存率。同時，于CLP手術后24小時收集實驗組和對照組小鼠的組織樣本，如外周血、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等。采用定量PCR和免疫組化法檢測小鼠膿毒癥后肝臟hepcidin的表達變化。采用蘇木素-伊紅(HE)染色的方法檢測肝臟和肺臟的組織病理變化。采用血清AST和ALT檢測的方法評估肝功能的變化。采用原位末端轉移酶標記(TUNEL)染色的方法檢測脾臟組織的凋亡損傷情況。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測外周血炎癥因子

8、IL-6和TNF-a的水平變化。采用瓊脂平板培養(yǎng)法檢測小鼠外周血和器官臟器的細菌感染情況。
　　結果:給予CLP膿毒癥手術后，肝源性hepcidin knockdown小鼠7天生存率較對照組明顯降低。CLP手術24小時后，與對照組相比較，肝源性hepcidinknockdown小鼠肝臟hepcidin的mRNA和蛋白表達水平均明顯降低。同時，肝源性hepcidin knockdown小鼠膿毒癥后肝臟損傷明顯加重，血清ALT和AST

9、水平明顯升高。肺組織損傷嚴重，肺損傷評分明顯增高。脾臟凋亡細胞的數(shù)量明顯增多。肝臟組織的NADPH氧化酶活性亦明顯增強，氧化應激損傷加重。此外，膿毒癥打擊后，肝源性hepcidin knockdown小鼠血漿炎癥因子水平較對照組明顯降低，外周血及肝臟和肺臟的細菌負荷較對照組明顯增多，而兩組小鼠脾臟的細菌數(shù)量無明顯差異。
　　結論:肝源性hepcidin knockdown小鼠膿毒癥的死亡率明顯增加。給予膿毒癥打擊后，肝源性hepc

10、idin knockdown小鼠臟器損傷、氧化應激和細菌感染程度均明顯加重，免疫反應能力亦明顯減弱。肝源性hepcidin在膿毒癥感染的免疫防御和預后中可能發(fā)揮重要作用。
　　第三部分肝源性hepcidin影響膿毒癥發(fā)生發(fā)展的機制研究
　　研究目的:肝源性hepcidin參與機體鐵穩(wěn)態(tài)的調節(jié)。感染和炎癥等刺激能夠誘導hepcidin的表達上調。hepcidin在感染和炎癥免疫中可能發(fā)揮著至關重要的作用。鑒于肝源性hepcid

11、in knockdown小鼠膿毒癥的7天生存率明顯降低，因此，本部分研究主要探討肝源性hepcidin影響膿毒癥發(fā)生發(fā)展的作用機制。
　　研究方法:采用盲腸結扎穿孔手術對肝源性hepcidin knockdown小鼠及對照組小鼠進行膿毒癥模型的復制，觀察術后24小時小鼠鐵代謝變化。采用原子吸收光譜法檢測血清鐵水平。采用普魯士藍染色和酸消化法檢測脾臟組織鐵含量。同時，給予小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞系以不同濃度的鐵螯合劑去鐵胺（

12、deferoxamine，DFO）處理，通過吞噬熒光顆粒的方法采用熒光顯微鏡和流式細胞術觀察巨噬細胞的吞噬能力，通過脂多糖(LPS)的刺激采用熒光定量PCR的方法檢測巨噬細胞的炎癥反應能力。最后，對肝源性hepcidin knockdown小鼠給予低鐵飲食聯(lián)合腹腔注射去鐵胺的方法處理，13天后檢測肝源性hepcidinknockdown小鼠血清鐵含量的水平。并且給予低鐵處理組小鼠和未給予低鐵處理組小鼠以膿毒癥的打擊，觀察兩組膿毒癥小鼠的

13、7天生存率。
　　結果:膿毒癥手術24小時后，與對照組小鼠相比較，肝源性hepcidin knockdown小鼠血清鐵含量明顯升高，脾臟巨噬細胞的鐵含量明顯減少。同時，經鐵螯合劑處理后的RAW264.7吞噬細胞，其細胞胞內吞噬熒光顆粒的數(shù)量及熒光顆粒的強度較未處理細胞均明顯降低，其對脂多糖(LPS)刺激后的炎癥反應能力亦明顯減弱，巨噬細胞炎癥因子IL-6的mRNA水平較未處理細胞明顯降低。此外，給予低鐵飲食聯(lián)合腹腔注射去鐵胺的方法

14、處理肝源性hepcidin knockdown小鼠后，肝源性hepcidin knockdown小鼠血清高鐵負荷狀態(tài)明顯改善。給予膿毒癥打擊后，低鐵處理后的肝源性hepcidin knockdown小鼠膿毒癥的7天生存率亦明顯改善。
　　結論:肝源性hepcidin knockdown小鼠膿毒癥后鐵代謝紊亂，表現(xiàn)為血清鐵水平明顯升高，脾臟巨噬細胞鐵含量明顯減少。胞內鐵含量減少明顯抑制巨噬細胞的吞噬功能和炎癥反應能力。低鐵處理肝源性