Tim-4在小鼠膿毒癥發(fā)生中的作用及負調(diào)控巨噬細胞功能的機制研究.pdf

1、膿毒癥(Sepsis)是嚴重創(chuàng)傷、燒傷、休克、外科大手術(shù)后常見的并發(fā)癥，進一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征(Multiple Organ dysfanctionSyndrome，MODS)等，已成為臨床危重患者的重要死亡原因之一。據(jù)報道，臨床危重病人中約有25％發(fā)展為膿毒癥，10％～15％發(fā)展為嚴重膿毒癥或膿毒癥性休克。近年的臨床研究證實，革蘭陰性菌感染引起的內(nèi)毒素(Lipopolysaccharides，LPS)釋放是導(dǎo)

2、致膿毒癥的重要因素。資料表明，LPS通過與單核巨噬細胞膜上的Toll樣受體4(Toll-Like Receptor4，TLR4)結(jié)合將信號轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，導(dǎo)致細胞活化、釋放各種炎癥介質(zhì)，如：TNF-α、IL-1β和IL-6，這些細胞因子進而作為內(nèi)源性介質(zhì)，通過旁分泌或體循環(huán)遠程分泌到達靶組織和靶細胞部位進而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，引起全身性炎癥反應(yīng)。因而，巨噬細胞在LPS介導(dǎo)的膿毒癥中發(fā)揮重要作用，深入研究膿毒癥中巨噬細胞的活化及調(diào)控機制具有重要意義

3、。T細胞免疫球蛋白粘蛋白(T cell immunoglobulin domain and muein domainprotein，Tim)基因家族是2001年在對哮喘的研究中發(fā)現(xiàn)的一個新基因家族，定位于小鼠染色體11B1.1，該區(qū)域與多種疾病的發(fā)生有密切的關(guān)系，如哮喘、過敏反應(yīng)和自身免疫性疾病。小鼠Tim家族有8個基因，分別編碼蛋白Tim-1～4和4個假想蛋白Tim-5～8。不同于其它的Tim分子，Tim-4并不表達在T細胞表面，而是

4、選擇性表達于抗原提呈細胞(Antigen presenting cells，APCs)，特別是髓系來源的樹突狀細胞和巨噬細胞表面。研究表明，Tim-4是另一家族成員Tim-1的配體，二者相互作用，可向T細胞傳導(dǎo)活化或抑制信號，調(diào)節(jié)T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。新近研究表明，Tim-4可以作為磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserinc；PtdSer，PS)的受體，通過與凋亡細胞表面的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，促進對凋亡細胞的吞噬。吞噬凋亡細胞是巨

5、噬細胞的重要功能，Tim-4作為PS受體，參與巨噬細胞吞噬凋亡細胞，提示Tim-4分子可能參與調(diào)節(jié)巨噬細胞功能，從而可能參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。為了明確Tim-4分子是否參與巨噬細胞的調(diào)節(jié)，本課題組前期以巨噬細胞系RAW264.7為研究模型，研究發(fā)現(xiàn)，Tim-4可通過下調(diào)共刺激分子CD80、CD86及MHCII類的表達負性調(diào)節(jié)小鼠巨噬細胞RAW264.7的生物學(xué)活性。此外，利用刀豆蛋白A(Concanavalin A，ConA)誘導(dǎo)小鼠急

6、性肝損傷模型，研究發(fā)現(xiàn)，將穩(wěn)定過表達Tim-4的小鼠巨噬細胞系RAW264.7-Tim-4回輸?shù)叫∈篌w內(nèi)可以減輕ConA誘發(fā)的小鼠急性肝損傷，初步提示Tim-4負性調(diào)節(jié)巨噬細胞系RAW264.7的功能。然而，Tim-4對巨噬細胞的調(diào)節(jié)作用尚需在多種細胞體系中進行驗證。此外，Tim-4調(diào)控巨噬細胞的通路是什么，Tim-4介導(dǎo)的巨噬細胞調(diào)控是否與巨噬細胞相關(guān)疾病發(fā)生相關(guān)，迄今尚未報道。本文首先研究Tim-4介導(dǎo)的巨噬細胞調(diào)控在膿毒癥中的作用

7、，進而利用小鼠巨噬細胞系RAW254.7及小鼠腹腔巨噬細胞為模型，體外探討Tim-4對LPS/TLR4介導(dǎo)的巨噬細胞活化的調(diào)控作用及分子機制，在此基礎(chǔ)上研究Tim-4對poly(I：C)及IFN-γ介導(dǎo)的巨噬細胞活化的調(diào)節(jié)作用，為深入闡明膿毒癥的發(fā)病機制和Tim-4在固有免疫中的作用提供實驗依據(jù)，并為膿毒癥的治療提供新的靶點。
　　 第一部分：Tim-4負性調(diào)節(jié)LPS介導(dǎo)的小鼠巨噬細胞活化，抑制LPS介導(dǎo)的小鼠膿毒癥。LPS/T

8、LR4介導(dǎo)巨噬細胞活化并釋放多種效應(yīng)分子是巨噬細胞發(fā)揮功能的重要基礎(chǔ)，大量LPS釋放介導(dǎo)巨噬細胞過度活化導(dǎo)致膿毒血癥，是臨床常見并發(fā)癥。本課題首先研究Tim-4對LPS/TLR4介導(dǎo)巨噬細胞活化的調(diào)控作用及機制，并探討Tim-4介導(dǎo)的巨噬細胞活化在膿毒癥中的作用。⑴體內(nèi)實驗表明，Tim-4抑制LPS介導(dǎo)的小鼠膿毒癥。在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥模型中，LPS首先激活巨噬細胞合成和釋放各種細胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6，這些細胞因子以

9、受體介導(dǎo)的作用方式發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，進而引起全身性炎癥反應(yīng)。因而，巨噬細胞的激活在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥模型中居于核心地位。為此，本論文以LPS誘導(dǎo)的膿毒癥為模型，研究Tim-4在體內(nèi)對巨噬細胞的調(diào)控作用。①LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠中Tim-4 mRNA表達升高。BALB/c小鼠腹腔注射15mg/kg LPS建立膿毒癥模型，8h后，取各臟器，RT-PCR檢測Tim-4mRNA表達。結(jié)果顯示，相對于對照小鼠，膿毒癥小鼠中骨髓來源巨噬細胞、脾臟和肺

10、組織中Tim-4 mRNA的表達升高(p<0.05)，但膿毒癥小鼠中腎臟Tim-4 mRNA的表達未見上調(diào)。②聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI)攜載體內(nèi)轉(zhuǎn)染方法的建立。為研究Tim-4在LPS介導(dǎo)膿毒癥中的作用，我們設(shè)計在體內(nèi)進行Tim-4過表達或Tim-4shRNA抑制。本論文采用聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI)攜載質(zhì)粒后進行尾靜脈注射，建立有效的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染方法。為驗證該方法的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率，

11、本實驗首先將表達綠色熒光的pEGFP-N1質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑PEI混合后(PEI攜載)尾靜脈輸入小鼠體內(nèi)，不同時間點后取組織，切片后熒光顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，注射pEGFP-N1質(zhì)粒2天和5天的脾臟均有較強綠色熒光，說明PEI攜載可有效將pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入小鼠體內(nèi)并在體內(nèi)表達目的基因。③Tim-4過表達明顯減緩LPS誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥。為進一步驗證Tim-4對膿毒癥的影響，我們構(gòu)建了pEGFP-N1-Tim-4表達載體。PEI攜載后尾

12、靜脈注射，3天后處死小鼠，取肝、脾、肺和腎，抽提RNA。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，注射pEGFP-N1-Tim-4質(zhì)粒的小鼠，肝、脾、肺和腎中Tim-4表達升高，說明pEGFP-N1-Tim-4質(zhì)粒成功輸入小鼠體內(nèi)并表達。BALB/c小鼠尾靜脈注射PEI攜載的60μg pEGFP-N1-Tima-4(pEGFP-N1質(zhì)粒為對照)質(zhì)粒，24h后腹腔注射15mg/kg LPS誘導(dǎo)膿毒癥，同上觀察生存率并檢測血清細胞因子表達。結(jié)果表明，與對照

13、pEGFP-N1質(zhì)粒處理組相比，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Tim-4質(zhì)粒小鼠生存率顯著升高(n=10，p<0.05)，并且死亡時間推遲，且細胞因子TNF-α和IL-6的分泌下調(diào)(TNF-α：1.808±0.104ng/mLvs1.46±0.071ng/mL；IL-6:42.9±4.315 ng/mL vs27.7±4.326 ng/mL，n=6，p<0.05)，提示Tim-4過表達可減緩LPS誘導(dǎo)的膿毒癥。④shRNA抑制Tim-4表達，顯

14、著加劇LPS誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥。構(gòu)建Tim-4 shRNA表達質(zhì)粒，PEI攜載后尾靜脈注射BALB/c小鼠，3天后處死小鼠，抽提組織RNA。RT-PCR結(jié)果顯示，Tim-4 shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)輸組小鼠脾臟及肺臟Tim-4 mRNA表達降低，提示構(gòu)建的shRNA在體內(nèi)能有效抑制Tim-4表達。Tim-4 shRNA表達質(zhì)粒預(yù)處理BALB/c小鼠24h后，腹腔注射15mg/kg LPS誘導(dǎo)膿毒癥，LPS注射12h后收集血清用于細胞因子測定，并觀

15、察小鼠生存率.結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)輸對照Control shRNA質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染Tim-4 shRNA質(zhì)粒小鼠生存率顯著降低(n=10，p<0.05)。ELISA分析顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)輸Tim-4shRNA質(zhì)粒小鼠細胞因子TNF-α和IL-6的分泌增加(TNF-α：1.64±0.077ng/mLvs2.102±0.16ng/mL；IL-6:27±5.657ng/mL vs49±7.434ng/mL，n=6，p<0.05)。述體內(nèi)過表達及

16、shRNA抑制實驗結(jié)果顯示，Tim-4在LPS介導(dǎo)的小鼠膿毒癥中發(fā)揮重要保護作用。⑵Tim-4對LPS介導(dǎo)的巨噬細胞活化的調(diào)節(jié)作用及分子機制。LPS是巨噬細胞活化的強激活劑，可引起細胞因子合成和釋放，導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)發(fā)生。為了進一步研究Tim-4對巨噬細胞的調(diào)控作用，本研究首先檢測了活化狀態(tài)下巨噬細胞Tim-4的表達。①LPS刺激促進體外培養(yǎng)小鼠巨噬細胞中Tim-4的表達。分別以0、10、50和100ng/mL為終濃度的LPS刺激小鼠

17、巨噬細胞系RAW264.724h，RT-PCR結(jié)果顯示，LPS刺激可以促進Tim-4 mRNA表達，相對于未刺激組，LPS刺激組細胞Tim-4 mRNA表達逐漸上調(diào)，呈現(xiàn)劑量依賴性。此外，以100ng/mL LPS刺激RAW264.7，隨時間延長(6h、12h和24h)Tim-4mRNA的表達逐漸升高，并在24h達到高峰。Western Blot檢測上述處理組細胞中Tim-4蛋白表達，得到了相同的結(jié)果。以上結(jié)果顯示，小鼠巨噬細胞系RAW

18、264.7經(jīng)LPS活化后Tim-4表達上調(diào)且呈劑量及時間依賴性。為驗證上述結(jié)果，我們利用小鼠腹腔巨噬細胞重復(fù)上述實驗，RT-PCR結(jié)果顯示，小鼠腹腔巨噬細胞經(jīng)LPS活化后Tim-4 mRNA表達上調(diào)且呈劑量及時間依賴性。②Tim-4抑制LPS介導(dǎo)的小鼠巨噬細胞NO及細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-β)分泌。為了研究Tim-4對LPS/TLR4介導(dǎo)的小鼠巨噬細胞活化的調(diào)節(jié)作用，本研究利用Tim-4過表達、Tim-4 s

19、hRNA及Tim-4阻斷型抗體預(yù)處理(阻斷Tim-4通路)三種方法，分別從正反兩方面研究Tim-4對LPS/TLR4介導(dǎo)巨噬細胞分泌NO和細胞因子功能的影響。利用本課題組前期篩選獲得的穩(wěn)定表達小鼠Tim-4的巨噬細胞系RAW264.7-pcDNA3-Tim-4為研究對象，Griess法檢測結(jié)果顯示，LPS刺激24h后，Tim-4穩(wěn)定表達巨噬細胞NO的分泌明顯低于對照細胞(37.47±1.129μM vs43.37±1.66μM，p<0.

20、05)。Western Blot檢測顯示，經(jīng)LPS刺激12h，穩(wěn)定表達Tim-4巨噬細胞iNOS蛋白表達亦低于對照細胞系。為了進一步驗證上述結(jié)果，分別將不同劑量(0.2μg、0.6μg及1μg)pcDNA3-Tim-4及pcDNA3表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠腹腔巨噬細胞。Griess法檢測顯示，隨著pcDNA3-Tim-4轉(zhuǎn)染劑量的增加，LPS介導(dǎo)的巨噬細胞NO分泌明顯降低，LPS刺激24h，0.6μg及1μg pcDNA3-Tim-4轉(zhuǎn)染組

21、細胞NO分泌量分別為17±2.3μM、14.79±1.5μM，較對照組細胞(20.05±1.2μM，20.38±0.67μM)明顯下調(diào)(p<0.05)。ELISA檢測結(jié)果顯示，隨著pcDNA3-Tim-4轉(zhuǎn)染劑量的增加，LPS介導(dǎo)的巨噬細胞細胞因子分泌顯著降低：與對照組比較，LPS刺激6h后，轉(zhuǎn)染0.6μg pcDNA3-Tim-4的巨噬細胞分泌IL-6的量顯著降低(515.0±36.10pg/mL vs661.0±29.51 pg/m

22、L，p<0.05)；而轉(zhuǎn)染1μg pcDNA3-Tim-4細胞產(chǎn)生TNF-α分泌(1960±88.64pg/mL vs2639±127pg/mL，p<0.05)及IL-6的水平(460.3±27.48 pg/mL vs610.3±21.31 pg/mL，p<0.05)均明顯下調(diào)。轉(zhuǎn)染不同劑量pcDNA3-Tim-4后巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β和IL-10的水平與對照組無顯著性差異。Real-Time PCR檢測結(jié)果顯示，1μg pcDNA3

23、-Tim-4轉(zhuǎn)染組細胞與對照pcDNA3組細胞相比，細胞因子IFN-β mRNA的表達下調(diào)。以不同劑量的Tim-4 shRNA轉(zhuǎn)染小鼠腹腔巨噬細胞48h，LPS刺激后分別在6h、24h收集上清，Griess法檢測NO，ELISA檢測細胞因子表達。結(jié)果顯示，與對照shRNA組細胞相比，1μg Tim-4 shRNA轉(zhuǎn)染組細胞NO分泌上調(diào)；0.6μg Tim-4 shRNA轉(zhuǎn)染組細胞IL-6的分泌增加(641.7±40.83pg/mL vs

24、504.3±13.86pg/mL，p<0.05)；1μg Tim-4 shRNA轉(zhuǎn)染組細胞TNF-α、IL-1β及IL-6分泌均升高(TNF-α：2514±174.7pg/mL vs1962±74.54pg/mL，p<0.05，IL-1β：1247±53.39 pg/mL vs845.3±66.03 pg/mL；IL-6:785.3±29.21 vs477.7±29.19，p<0.005)。IL-10的分泌無統(tǒng)計學(xué)差異。以不同濃度(終濃

25、度為1μ g/mL、2.5μg/mL和5μg/mL)的Tim-4阻斷型抗體預(yù)處理小鼠腹腔巨噬細胞1h后，LPS刺激不同時間，同上檢測NO及細胞因子的表達。結(jié)果顯示，終濃度為5μg/mL Tim-4抗體處理組NO的分泌高于IgG對照組(37.43±0.81μM vs32.73±0.98μM，p<0.05)。Western Blot檢測顯示5μg/mL Tim-4抗體阻斷組細胞iNOS蛋白表達明顯上調(diào)，與上述NO結(jié)果相符。ELISA檢測結(jié)果

26、顯示，5μg/mL Tim-4抗體處理組細胞TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌均明顯高于IgG對照組(TNF-α：4032±42.7 pg/mL vs3589±118.3pg/mL；IL-1β：901±20.8 pg/mL vs759±44 pg/mL；IL-6:664±25 vs530±23.1，p<0.05)，而IL-10的分泌無統(tǒng)計學(xué)差異。Real-Time PCR檢測結(jié)果顯示，5μg/mL Tim-4抗體組IFN-β mRN

27、A的表達明顯高于IgG對照組(p<0.05)。以上研究結(jié)果提示，Tim-4基因沉默或功能阻斷可促進小鼠巨噬細胞NO及細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌及IFN-β的產(chǎn)生。綜合上述結(jié)果，當(dāng)小鼠巨噬細胞受到LPS刺激活化時Tim-4表達上調(diào)，上調(diào)的Tim-4抑制LPS活化的小鼠巨噬細胞產(chǎn)生NO及細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-β)，提示Tim-4抑制LPS介導(dǎo)的巨噬細胞活化。③Tim-4抑制LPS介導(dǎo)巨噬細胞

28、活化的分子機制研究。LPS作為TLR4的配體通過MyD88依賴途徑和MyD88非依賴途徑介導(dǎo)巨噬細胞活化并產(chǎn)生各種效應(yīng)分子。LPS/TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴性途徑中通過激活MyD88/IL-1R相關(guān)激酶/TRAF6激活MAPK(ERK、p38和JNK)和NF-κB通路，從而產(chǎn)生促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α等；而LPS始動的MyD88非依賴途徑通過活化TRIF依賴的IRF的激活調(diào)節(jié)IFN誘導(dǎo)基因的表達，如：IFN-β的表達

29、。為研究Tim-4抑制LPS/TLR4介導(dǎo)的巨噬細胞活化機制，本研究檢測Tim-4過表達或阻斷后MyD88依賴途徑和MyD88非依賴途徑中的各關(guān)鍵蛋白。利用Tim-4過表達巨噬細胞研究NF-κB在Tim-4介導(dǎo)的巨噬細胞調(diào)控中的作用。Western Blot檢測顯示，與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒細胞相比，LPS(終濃度100 ng/mL)刺激30 min及60min時Tim-4過表達RAW264.7細胞p-NF-κB p65蛋白的表達均顯著降低，提示

30、Tim-4過表達抑制巨噬細胞NF-κB活化。NF-κB抑制性配體預(yù)處理Tim-4穩(wěn)定表達的小鼠的巨噬細胞RAW264.7及對照細胞，Griess法及ELISA檢測LPS刺激后巨噬細胞產(chǎn)生NO及細胞因子的水平。結(jié)果顯示，LPS刺激24h時，NF-κB抑制性配體未處理組，Tim-4轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞NO分泌減少(22.59±1.13μM vs27.6±0.36μM，p<0.05)，TNF-α和IL-6的分泌降低(TNF-α：2956

31、±96.81pg/mL vs3634±96.81pg/mL；IL-6：753.0±57.14pg/mL vs1121±64.16pg/mL，p<0.05)；而NF-κB抑制性配體處理后，Tim-4轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞NO、TNF-α和IL-6的分泌均與對照無顯著性差異。NF-κB是MyD88依賴途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，為研究NF-κB通路在Tim-4介導(dǎo)的巨噬細胞調(diào)節(jié)中的作用，我們利用終濃度為5μg/mL的Tim-4阻斷型抗體預(yù)處理

32、小鼠腹腔巨噬細胞，Western Blot檢測顯示，LPS刺激30 min及60min時，Tim-4阻斷型抗體預(yù)處理組p-NF-κB p65蛋白的表達升高，提示Tim-4信號的阻斷促進了NF-κB通路的活化。進一步利用NF-κB抑制性配體預(yù)處理腹腔巨噬細胞30min后加入小鼠Tim-4阻斷型抗體(終濃度為5μg/mL)處理1h，Griess法及ELISA檢測LPS刺激后巨噬細胞產(chǎn)生NO及細胞因子的水平。結(jié)果顯示，LPS刺激24h，NF-

33、κB抑制性配體未處理組，Tim-4阻斷型抗體作用巨噬細胞NO分泌增加(36.57±1.84μM vs27.27±1.53μM，p<0.05)，且TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌增加(TNF-α：4270±152.8 pg/mL vs3461±237.2 pg/mL；IL-1β：1842±157.94 pg/mL vs1304±130.4 pg/mL；IL-6:1340±117.3 pg/mL vs850.3±73.04 pg/mL

34、，p<0.05)2而NF-κB抑制性配體處理組，Tim-4阻斷型抗體處理后NO及TNF-α、IL-β和IL-6的分泌均無統(tǒng)計學(xué)差異。MAPK活化是MyD88依賴性途徑中另一重要環(huán)節(jié).本研究設(shè)計利用抗體阻斷及過表達，進一步研究MAPK通路在Tim-4介導(dǎo)的巨噬細胞調(diào)控中的作用。pcDNA3.0-Tim-4轉(zhuǎn)染小鼠腹腔巨噬細胞(pcDNA3.0轉(zhuǎn)染組為對照)后LPS刺激不同時間，Western Blot檢測不同MAPK蛋白組成的表達.結(jié)果顯

35、示，與RAW264.7-pcDNA3.0組細胞相比，Tim-4轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞在LPS刺激不同時間后細胞內(nèi)p-p38和p-ERK1/2蛋白的表達顯著降低，提示Tim-4過表達抑制MAPK通路活化。利用終濃度為5μg/mL Tim-4阻斷型抗體及對照IgG預(yù)處理小鼠腹腔巨噬細胞，Western Blot檢測MAPK通路關(guān)鍵分子表達.結(jié)果顯示，LPS刺激15min、30 min及60min時，Tim-4阻斷型抗體預(yù)處理組p-p38

36、和p-ERK1/2蛋白的表達顯著上調(diào)，提示阻斷Tim-4促進MAPK通路活化。Western Blot檢測p-IRF3蛋白表達。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載體的RAW264.7細胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-Tim-4的RAW264.7細胞在LPS刺激15min、30 min及60min后細胞內(nèi)p-IRF3蛋白表達均顯著降低，提示Tim-4過表達抑制IRF3信號通路的活化。Western Blot結(jié)果顯示，與對照組相比，Tim-4阻斷型抗體預(yù)處

37、理的小鼠腹腔巨噬細胞表達p-IRF3水平上調(diào)，提示阻斷Tim-4信號促進了LPS/MyD88非依賴途徑中IRF3的活化。
　　 第二部分：Tim-4對poly(I：C)介導(dǎo)的小鼠巨噬細胞分泌NO的負調(diào)節(jié)作用及機制。為了進一步研究Tim-4對巨噬細胞功能的調(diào)控，我們初步探討了Tim-4對poly(I：C)介導(dǎo)小鼠巨噬細胞分泌NO的調(diào)控作用及機制。⑴poly(I：C)促進小鼠腹腔巨噬細胞Tim-4 mRNA的表達。不同濃度poly(

38、I：C)刺激小鼠腹腔巨噬細胞24h，RT-PCR檢測Tim-4表達。結(jié)果顯示，20μg/mL和50μg/mL poly(I：C)刺激后小鼠腹腔巨噬細胞Tim-4 mRNA表達升高(p<0.05)。Griess法檢測顯示，poly(I：C)刺激24h后，與對照細胞相比，Tim-4穩(wěn)定表達巨噬細胞的NO分泌明顯降低(25.13±1.6μM vs16.45±1.9μM，p<0.05)。Griess法檢測結(jié)果顯示，與對照IgG相比，終濃度為5μ

39、g/mL的抗體阻斷Tim-4可以促進poly(I：C)誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細胞NO的產(chǎn)生(20.47±1.85μM vs26.73±1.19μM，p<0.05)。利用Tim-4過表達巨噬細胞驗證NF-κB在Tim-4調(diào)控巨噬細胞分泌NO中的作用。NF-κB抑制性配體預(yù)處理Tim-4穩(wěn)定表達的小鼠巨噬細胞系RAW264.7及對照細胞30min后，poly(I：C)刺激24h，收集培養(yǎng)上清。Gdess法檢測顯示，NF-κB抑制性配體未處理組，

40、RAW264.7-pcDNA3.0-Tim-4細胞與對照細胞相比，NO分泌下調(diào)(14.93±1.24μM vs21.27±1.7μM，p<0.05)；而NF-κB抑制性配體處理組，RAW264.7-pcDNA3.0-Tim4細胞與對照細胞相比，NO分泌無差異(p<0.05)。為了研究阻斷Tim-4是否通過NF-κB調(diào)控NO的分泌，我們利用NF-κB抑制性配體及對照預(yù)處理腹腔巨噬細胞30min，然后加入羊IgG及羊抗小鼠Tim-4阻斷型抗

41、體(終濃度為5μg/mL)處理1h，Griess法檢測顯示，poly(I：C)刺激24h，NF-κB抑制性配體未處理組，Tim-4阻斷型抗體組NO分泌較羊IgG明顯增加(33.23±1.31μM vs22.6±1.35μM，p<0.05)；而NF-κB抑制性配體處理后，Tim-4阻斷型抗體組NO分泌與羊IgG對照組無顯著性差異。
　　 第三部分：Tim-4對IFN-γ介導(dǎo)的小鼠巨噬細胞分泌NO的負調(diào)節(jié)作用。TFN-γ是巨噬細胞活

42、化的另一重要刺激劑。為全面了解Tim-4對活化巨噬細胞的調(diào)控，我們以IFN-γ活化的巨噬細胞為研究對象，進一步探討Tim-4對活化巨噬細胞的調(diào)控。⑴IFN-γ上調(diào)小鼠腹腔巨噬細胞Tim-4 mRNA的表達。RT-PCR結(jié)果顯示，100U/mL IFN-γ刺激小鼠腹腔巨噬細胞6h、12h和24h后，Tim-4mRNA的表達于24h顯著上調(diào)(p<0.001)。利用本課題組前期成功篩選獲的得穩(wěn)定表達小鼠Tim-4的巨噬細胞系RAW264.7-

43、pcDNA3-Tim-4，Griess法檢測顯示，經(jīng)IFN-γ刺激24h，穩(wěn)定表達Tim-4細胞系NO的分泌低于對照細胞系RAW264.7-pcDNA3(19.33±μM vs24.93±1.507μM，p<0.05)。Western Blot檢測顯示，經(jīng)IFN-γ刺激12h，穩(wěn)定表達Tim-4細胞系iNOS蛋白表達亦低于對照細胞系。利用Tim-4阻斷型抗體預(yù)處理小鼠巨噬細胞，進一步研究封閉Tim-4對巨噬細胞功能的影響。Griess法

44、檢測結(jié)果顯示，與對照IgG相比，利用終濃度為5μg/mL抗體阻斷Tim-4可以促進IFN-γ活化的小鼠腹腔巨噬細胞NO的產(chǎn)生(21.6±1.78μM vs28.13±0.96μm，p<0.05).Western Blot檢測顯示5μg/mL Tim-4抗體阻斷組，iNOS蛋白的表達亦上調(diào)。⑵TFN-γ與細胞表面受體結(jié)合可招募Jak2并發(fā)生磷酸化，而磷酸化的Jak2(p-Jak2)可使Stat1磷酸化，磷酸化的Stat1(p-Stat1)

45、入細胞核內(nèi)結(jié)合到iNOS啟動子區(qū)，啟動iNOS的表達，而iNOS是NO合成的限速酶。Western Blot檢測顯示，終濃度為5μg/mL Tim-4阻斷型抗體預(yù)處理腹腔巨噬細胞，TFN-γ刺激30min及60min時，與對照組相比，Tim-4阻斷型抗體預(yù)處理的細胞p-Jak2及p-Stat1蛋白的表達上調(diào)，可見Tim-4信號的阻斷上調(diào)了Jak2/Stat1通路的活化。以上結(jié)果提示，Tim-4可能通過抑制IFN-γ/Jak2/Stat1