維生素D3仰制LPS誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的作用機(jī)制研究.pdf

1、 目的：維生素D3參與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié),與機(jī)體固有免疫有關(guān),維生素D3具有抗氧化作用,但其在氧化應(yīng)激中的作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過LPS誘導(dǎo)氧化應(yīng)激與DNA損傷,并觀察維生素D3對(duì)LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與DNA損傷的保護(hù)作用,并就其機(jī)制進(jìn)行研究。方法：選用人B淋巴母細(xì)胞株,分為PBS對(duì)照組、LPS組、LPS+維生素D3組。采用ROS探針,用酶標(biāo)儀和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平；采用單細(xì)胞電泳彗星實(shí)驗(yàn)(COMET SOP),用激光共

2、聚焦顯微鏡檢測(cè)DNA損傷；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)和共聚焦免疫熒光顯微鏡,用Annexin v-FITC方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡；使用Edu增殖試劑盒和CCK8增殖試劑盒,檢測(cè)細(xì)胞增殖。用免疫熒光結(jié)合Edu增殖檢測(cè)方法觀察增值細(xì)胞中NF-kB磷酸化和NF-kB表達(dá)；6、用免疫印跡方法檢測(cè)NFkB磷酸化、NF-kB和TNF-α表達(dá)。結(jié)果：1、全波長(zhǎng)分光光度儀(酶標(biāo)儀)結(jié)果顯示, LPS組ROS的OD值(0.1914±0.149)明顯高于PBS對(duì)照組(0

3、.0375±0.0021) (P<0.05),顯示LPS能夠誘導(dǎo)細(xì)胞ROS產(chǎn)生；LPS+維生素D3組其ROS的OD值(0.1031±0.0058)明顯低于LPS組(0.1914±0.149)(P<0.05),顯示LPS+維生素D3組能夠明顯的抑制LPS誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激；同時(shí)使用共聚焦熒光顯微鏡結(jié)果顯示：LPS刺激組熒光強(qiáng)度值(64.82 ±4.43)明顯高于PBS對(duì)照組(13.45±0.91)(P<0.05),顯示LPS能夠誘導(dǎo)細(xì)胞

4、ROS產(chǎn)生；LPS+維生素D3組其熒光強(qiáng)度值為：(48.24±1.46)明顯低于LPS刺激組組(64.82±4.43)(P<0.05),顯示LPS+維生素D3刺激組能夠明顯的抑制LPS誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激； 2、單細(xì)胞電泳(彗星實(shí)驗(yàn))檢測(cè)受損細(xì)胞尾長(zhǎng),LPS刺激組細(xì)胞尾長(zhǎng)值(943.41±96)明顯高于對(duì)PBS對(duì)照組(98.52±43)(P<0.01),顯示LPS能夠誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷；LPS+維生素D3刺激組細(xì)胞尾長(zhǎng)值(286.43±

5、52)明顯低于LPS刺激組(943.41±96)(P<0.01)；顯示LPS+維生素D3刺激組能夠明顯的抑制LPS誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷；3、共聚焦熒光顯微觀察細(xì)胞凋亡顯示：1ug/ml LPS刺激組細(xì)胞凋亡值(13 ±1.41421)與PBS對(duì)照組(9±1.41421)(P>0.05)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；10ug/ml LPS刺激組細(xì)胞凋亡值(22.5±3.53553)與1ug/ml LPS刺激組(13±1.41421)(P>0.05)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

6、意義；PBS對(duì)照組細(xì)胞凋亡值(9±1.41421)與10ug/ml LPS刺激組凋亡值(22.5±3.53553)(P>0.05)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡值顯示： 1ug/ml LPS刺激組細(xì)胞凋亡值(30.3±6.237)與PBS對(duì)照組細(xì)胞凋亡值(20.3 ±2.45)(P>0.05)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；10ug/ml LPS刺激組細(xì)胞凋亡值(23.3±3.151)與1ug/ml LPS刺激組細(xì)胞凋亡值(30.3±6.237)(

7、P>0.05)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PBS對(duì)照組細(xì)胞凋亡值( 20.3 ± 2.45 )與10ug/ml LPS刺激組細(xì)胞凋亡值(23.3±3.151)(P>0.05)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；4、共聚焦熒光顯微鏡觀察(Edu染色法)細(xì)胞增殖顯示：LPS刺激組細(xì)胞增殖比(79.51±10.60)明顯高于PBS對(duì)照組細(xì)胞增殖比(9.34±1.41)(P<0.05)顯示LPS能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖；LPS+維生素D3刺激組細(xì)胞增殖比(48.68±6.34)明顯低于L

8、PS刺激組細(xì)胞增殖比(79.51±10.60)(P<0.05)顯示維生素D3能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)細(xì)胞增殖；同時(shí)使用全波長(zhǎng)分光光度儀(酶標(biāo)儀)檢測(cè)細(xì)胞OD值,LPS刺激組細(xì)胞細(xì)胞OD值為：(6.28±4.43)明顯高于對(duì)PBS對(duì)照組(0.75 ±0.13)(P<0.05)顯示LPS能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖；LPS+維生素D3刺激組細(xì)胞OD值為：(4.08±0.93)明顯低于LPS組(6.28±0.43)(P<0.05)顯示LPS+維生素D3刺激

9、組能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)細(xì)胞增殖；LPS+維生素D3刺激組細(xì)胞OD值為：(4.08±0.93)高于PBS對(duì)照組(0.75±0.13)(P<0.05)顯示LPS+維生素D3刺激組存在細(xì)胞增殖。5、共聚焦熒光顯微鏡觀察增殖細(xì)胞在NF-kB磷酸化表達(dá)：LPS刺激組增殖細(xì)胞比為：(80.63±7.92)明顯高于對(duì)PBS對(duì)照組(9.72±1.34) (P<0.05)顯示LPS能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖；LPS+維生素D3刺激組細(xì)胞增殖比為：(40.32±4

10、.32)明顯低于LPS刺激組(80.63±7.92)(P<0.05)顯示LPS+維生素D3刺激組能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)細(xì)胞增殖；LPS+維生素D3刺激組細(xì)胞增殖比為：(40.32±4.32)高于PBS對(duì)照組(9.72±1.34)(P<0.05)顯示LPS+維生素D3刺激組存在細(xì)胞增殖。共聚焦熒光顯微鏡觀在察NF-kB細(xì)胞增殖比：LPS刺激組細(xì)胞增殖比為：(70.49±7.64、39)明顯高于PBS對(duì)照組(11.12±1.27)(P<0.

11、05)顯示LPS能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖；LPS+維生素D3刺激組細(xì)胞增殖比為：(39.11±3.72)明顯低于LPS刺激組(70.49±7.64、39)(P<0.05)顯示LPS+維生素D3刺激組能夠明顯抑制LPS誘導(dǎo)細(xì)胞增殖；LPS+維生素D3刺激組細(xì)胞增殖比為：(39.11±3.72)高于PBS對(duì)照組(11.12±1.27)(P<0.05)顯示LPS+維生素D3刺激組存在細(xì)胞增殖。6、用免疫印跡方法檢測(cè)NF-kB,NF-kB磷酸化和TNF

12、-a表達(dá),結(jié)果顯示：LPS能明顯誘導(dǎo)NFkB表達(dá), NF-kB磷酸化和TNF-a表達(dá),其光密度與Actin比較,LPS刺激組 NF-kB磷酸化(1.928±0.031)較PBS對(duì)照組(0.732±0.018)表達(dá)水平增高(P<0.05),表明LPS能誘導(dǎo)NF-kB磷酸化表達(dá)；LPS+維生素D3刺激組NF-kB磷酸化(0.972±0.024)較LPS刺激組(1.928±0.031)表達(dá)水平減低(P<0.05),表明維生素D3能抑制LPS誘

13、導(dǎo)NF-kB磷酸化表達(dá)。LPS組NF-kB光密度( 1.546 ± 0.058)較PBS對(duì)照組(0.841±0.014)表達(dá)水平增高(P<0.05),表明LPS能誘導(dǎo)NFkB表達(dá)；LPS+維生素D3刺激組NF-kB光密度(0.993 ±0.032)較LPS刺激組(1.546±0.058)表達(dá)水平減低(P<0.05),表明維生素D3能抑制LPS能誘導(dǎo)NF-kB表達(dá)；LPS刺激組TNF-α光密度(1.176±0.041)較PBS對(duì)照組(0.

14、891±0.027)表達(dá)水平增高(P<0.05),表明LPS能誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)；LPS+維生素D3刺激組TNF-α光密度(1.004±0.039)較LPS刺激組(1.176±0.041)表達(dá)水平減低(P<0.05),表明維生素D3能抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-a表達(dá)。結(jié)論：1.LPS能夠誘導(dǎo)人B淋巴母細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激,維生素D3能有效的抑制LPS誘導(dǎo)人B淋巴母細(xì)胞的氧化應(yīng)激。2.LPS能夠誘導(dǎo)人B淋巴母細(xì)胞的DNA損傷,維生素D3能有效的