新型壓電石英DNA傳感器微陣列的構(gòu)建及其在血液感染病原菌快速檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、背景： 近年來，隨著抗腫瘤藥物、免疫抑制劑等藥物使用和人工瓣膜、人工關(guān)節(jié)、留置靜脈導(dǎo)管等侵入性操作的增加，各種介入性診治手段應(yīng)用范圍的日益擴(kuò)大以及人群老齡化和免疫力低下的人群的出現(xiàn)，血液感染在醫(yī)院中的發(fā)生比率呈逐年遞增趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類健康。致病菌的檢出是診斷血液感染的唯一方法。目前，臨床上血液感染致病菌普遍采用的檢測(cè)方法主要有兩大類：一類是培養(yǎng)鑒定法，包括血液細(xì)菌培養(yǎng)及生化反應(yīng)等一系列過程，通常需要3～5天，耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣

2、；另一類是以免疫學(xué)方法為代表的快速檢測(cè)方法，如抗血清凝集試驗(yàn)、協(xié)同凝集試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫法等，但是這些方法存在著敏感度低和特異性差等問題，常常導(dǎo)致誤診和漏診，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床血液感染診斷的需要。16S rDNA是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA(16SrRNA)的基因，有“細(xì)菌化石”之稱，是近年來細(xì)菌分類和鑒定研究中的熱點(diǎn)，為病原菌的分子生物學(xué)快速檢測(cè)供了新的理想靶點(diǎn)。 壓電石英傳感器，又被稱為石英晶振微天平(quartz crys

3、tal microbalance，QCM)，是新發(fā)展起來的生物診斷技術(shù)，它綜合應(yīng)用了信息學(xué)、電子學(xué)、機(jī)械學(xué)、分子生物學(xué)等多學(xué)科技術(shù)，利用生物反應(yīng)過程中傳感器表面質(zhì)量負(fù)載發(fā)生的微小變化所引起的振蕩頻率的變化，對(duì)與傳感器表面生物敏感膜發(fā)生反應(yīng)的生物學(xué)大分子進(jìn)行分析。近年來，國(guó)內(nèi)外陸續(xù)有應(yīng)用壓電石英傳感器檢測(cè)病原微生物的報(bào)道，但是這些壓電石英DNA傳感器的檢測(cè)靈敏度尚未達(dá)到臨床檢測(cè)的要求，還局限于單一菌種檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)研究。 因此，結(jié)合本

4、課題組前期的工作基礎(chǔ)，本課題確定了五種臨床常見血液感染致病菌：大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌為研究對(duì)象，充分利用細(xì)菌16s rDNA序列的分子生物學(xué)特點(diǎn)，分別將酶生物信號(hào)放大系統(tǒng)和納米金磁微粒信號(hào)放大系統(tǒng)引入壓電石英DNA傳感器，構(gòu)建新型壓電石英DNA傳感器微陣列，進(jìn)而建立一種操作簡(jiǎn)單、敏感度高、特異性高的血液感染病原菌快速檢測(cè)方法，期望為壓電石英DNA傳感器微陣列進(jìn)一步應(yīng)用于普通實(shí)驗(yàn)室甚至野戰(zhàn)、

5、自然災(zāi)害等特殊領(lǐng)域提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： 1.在前期研究基礎(chǔ)上，對(duì)壓電石英DNA傳感器檢測(cè)平臺(tái)的硬件設(shè)施和軟件設(shè)施進(jìn)行改進(jìn)，增加控溫系統(tǒng)，加強(qiáng)電磁屏蔽，采用Visual C++編程語(yǔ)言升級(jí)頻率分析軟件為PESA4.0，對(duì)傳感器微陣列的穩(wěn)定性、重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)自組裝膜法進(jìn)行改進(jìn)，采用二硫代蘇糖醇(DTT)將巰基修飾的的寡核苷酸探針還原后再進(jìn)行自組裝法固定，探討探針固定影響因素，確定最適反應(yīng)條件。 2.利用V

6、ector NTI9.0軟件套組對(duì)目標(biāo)病原菌的16S rDNA序列進(jìn)行分析，確定16 S rDNA保守序列區(qū)域和可變序列區(qū)域；利用Primer Premier5.0軟件，針對(duì)16SrDNA保守區(qū)域序列，設(shè)計(jì)適用于目標(biāo)病原菌的PCR擴(kuò)增通用引物；利用ArrayDesigner4.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)各靶病原菌16 S rDNA可變區(qū)域序列的特異性寡核苷酸探針。探討雜交反應(yīng)各影響因素，優(yōu)化反應(yīng)體系，初步建立血液感染常見病原菌壓電石英DNA傳感器檢

7、測(cè)方法。 3.分別建立納米金磁微粒信號(hào)放大系統(tǒng)和酶生物信號(hào)放大系統(tǒng)：應(yīng)用特異性探針與生物素修飾靶序列復(fù)合體捕獲鏈霉親和素修飾的納米金磁微粒，增加石英晶振表面質(zhì)量負(fù)載；應(yīng)用生物素和鏈霉親和素之間的特異性結(jié)合及辣根過氧化物酶催化DAB生成不可溶沉淀附著于金膜表面，增加石英晶振表面質(zhì)量負(fù)載，放大壓電生物傳感器檢測(cè)信號(hào)，優(yōu)化信號(hào)放大系統(tǒng)反應(yīng)條件。將基于兩種信號(hào)放大系統(tǒng)的壓電石英DNA傳感器用于病原菌檢測(cè)，評(píng)價(jià)兩種信號(hào)放大系統(tǒng)的可行性和有

8、效性。建立基于壓電傳感器單元的EIS檢測(cè)系統(tǒng)，應(yīng)用EIS方法進(jìn)一步驗(yàn)證壓電石英傳感器檢測(cè)方法及信號(hào)放大系統(tǒng)的各步驟的真實(shí)性和可靠性。 4.以臨床108例血培養(yǎng)標(biāo)本為檢測(cè)對(duì)象，對(duì)兩種血液標(biāo)本中細(xì)菌基因組DNA的提取方法進(jìn)行比較，并以血培養(yǎng)鑒定法為參照方法，對(duì)建立的壓電石英DNA傳感器微陣列檢測(cè)方法進(jìn)行方法學(xué)比較和評(píng)估，確定臨床樣本檢測(cè)步驟。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建新一代小型化壓電石英傳感器檢測(cè)儀，檢測(cè)儀規(guī)格(25.0

9、±1.0)×(35.0±1.0)×(15.0±1.0)cm(長(zhǎng)×寬×高)。檢測(cè)系統(tǒng)穩(wěn)定性良好，10分鐘檢測(cè)氣相頻率變化為±1Hz，液相條件下頻率變化為±1Hz。鄰位檢測(cè)池插拔，不會(huì)對(duì)其它已經(jīng)穩(wěn)定諧振的傳感器造成影響，三通道間基本不存在干擾，達(dá)到了陣列化的要求。還原巰基化探針法法顯著提高了探針固定效率(p<0.05)，最適探針固定濃度為2μmol/l。 2.利用設(shè)計(jì)的通用引物可以一次性完成所有靶細(xì)菌16Sr DNA序列的順利擴(kuò)增，

10、電泳條帶明亮清晰，具有較好的重復(fù)性。自行設(shè)計(jì)的探針特異性強(qiáng)、可靠性好，探針間Tm值相差僅為0.5℃，基本上具有相同的雜交條件，可用于傳感器微陣列系統(tǒng)的檢測(cè)。檢測(cè)最適雜交溫度為40℃，雜交檢測(cè)時(shí)間為90min。 3.建立的兩種信號(hào)放大系統(tǒng)均可有效的提高信噪比，提高檢測(cè)的靈敏度，基于納米金磁微粒信號(hào)放大系統(tǒng)的壓電石英DNA傳感器可以檢測(cè)到2.0×10.CFU/ml的病原菌，基于酶生物信號(hào)放大系統(tǒng)的壓電石英DNA傳感器可以檢測(cè)到2.0

11、×10.CFU/ml的病原菌，與陰性對(duì)照和空白對(duì)照檢測(cè)信號(hào)比較，均有顯著性差異(p<0.01)。由于酶生物信號(hào)放大系統(tǒng)所引起的頻率變化值是納米金磁微粒引起的頻率變化值的2.1倍，因此，選擇酶生物信號(hào)放大系統(tǒng)為壓電石英DNA傳感器檢測(cè)血液感染病原菌的信號(hào)放大方法。 4.對(duì)兩種血液標(biāo)本中病原菌基因組DNA提取方法比較結(jié)果顯示，堿裂解法操作簡(jiǎn)便、污染機(jī)會(huì)少，而且效果好，能裂解所研究的所有菌種，PCR產(chǎn)物電泳條帶清晰明亮，無拖尾現(xiàn)象，可

12、作為有效的樣本前處理方法。檢測(cè)的108例臨床樣本中，其中102例傳感器檢測(cè)結(jié)果，與臨床檢測(cè)結(jié)果相符合，靈敏度為90.2％，特異度為98.5％，可靠性為90％。 結(jié)論： 1.我們所構(gòu)建的新型壓電石英DNA傳感器微陣列，降低了溫度和電磁效應(yīng)對(duì)檢測(cè)穩(wěn)定性的影響，極大的減少了各檢測(cè)通道之間的信號(hào)干擾，從而達(dá)到了傳感器陣列化的要求，為DNA檢測(cè)提供了背景噪音低、性能穩(wěn)定的微陣列檢測(cè)平臺(tái)。 2.自行設(shè)計(jì)的16Sr DNA通用

13、引物可以一次性對(duì)所有靶細(xì)菌16Sr DNA序列的順利擴(kuò)增：設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針特異性好，具有相同的雜交條件，較大的增加了傳感器微陣列的檢測(cè)通量，簡(jiǎn)化了操作步驟。 3.酶生物放大系統(tǒng)和納米金磁微粒檢測(cè)系統(tǒng)可顯著增加壓電傳感器檢測(cè)DNA靶序列時(shí)的頻率變化，有效提高壓電石英傳感器的信噪比，顯著提高檢測(cè)的靈敏度，為壓電生物傳感器檢測(cè)生物大分子提供了可靠的信號(hào)放大方法，在生物傳感器領(lǐng)域有較大的應(yīng)用潛力。 4.構(gòu)建的壓電石英DNA傳感