基于固定化酶技術(shù)的蛋白超聲輔助酶解反應(yīng)及其機(jī)理研究.pdf

1、近年來(lái)，超聲輔助蛋白酶解制備多肽成為研究的熱點(diǎn)。大量的研究發(fā)現(xiàn)，超聲波對(duì)酶解反應(yīng)過(guò)程有顯著的促進(jìn)作用，但超聲強(qiáng)化蛋白酶解的機(jī)制尚不完善。目前報(bào)道的研究主要集中在超盧預(yù)處理對(duì)底物蛋白可酶解性的影響和對(duì)蛋白酶活性的影響，關(guān)于在超聲場(chǎng)進(jìn)行酶解反應(yīng)（稱其為超聲輔助酶解）的機(jī)理研究欠缺，其根本原因在于酶與蛋白混合在一起，分別獲取蛋白和酶的結(jié)構(gòu)特征和性質(zhì)變化的信息十分困難。本文旨在通過(guò)固定化酶技術(shù)將蛋白酶固定化，待酶解結(jié)束后將蛋白酶與蛋白酶解產(chǎn)物有

2、效分離開來(lái)，分別研究超聲波對(duì)兩者的分子構(gòu)象的影響，從而探明超聲強(qiáng)化蛋白酶解反應(yīng)過(guò)程的分子機(jī)制與結(jié)構(gòu)特征。
　　本文研究了海藻酸鈉固定化堿性蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì);以酪蛋白為底物，研究了固定化酶的最適反應(yīng)條件并基于此結(jié)論，研究了酶解過(guò)程施加超聲對(duì)菜籽蛋白酶解效果的影響;采用理化分析、光譜學(xué)方法和掃描電鏡等分析測(cè)試手段對(duì)酶解反應(yīng)后的蛋白酶與蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，研究了超聲促進(jìn)蛋白酶解的反應(yīng)的分子機(jī)制;針對(duì)傳統(tǒng)固定化酶載體和技術(shù)存在的缺陷

3、，采用磁載體的方式對(duì)堿性蛋白酶進(jìn)行固定化并應(yīng)用于菜籽蛋白的超聲輔助酶解，進(jìn)一步探究、驗(yàn)證了超聲強(qiáng)化蛋白酶解反應(yīng)的機(jī)理。本文得出以下主要結(jié)論:
　　(1)通過(guò)一種在海藻酸鈉上固定化酶的方法得到固定化堿性蛋白酶，測(cè)定蛋白酶的最適pH為10、最適溫度為60℃，獲得的固定化堿性蛋白酶的熱穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性較好。以酪蛋白為模式蛋白，檢驗(yàn)此固定化堿性蛋白酶的基本性能，判斷能否可用于后續(xù)的超盧輔助酶解機(jī)理研究，取得了肯定的效果，并獲得了酪蛋白最

4、佳反應(yīng)條件為:溫度60℃、pH9.5、底物濃度5％、加酶量960 U/g、酶解時(shí)間300 min。
　　(2)以水解度和殘余酶活為指標(biāo)，進(jìn)行了菜籽蛋白超聲輔助固定化酶酶解試驗(yàn)研究。建立影響菜籽蛋白水解度的二次多項(xiàng)回歸方程，在超聲掃頻周期500ms、脈沖超聲工作時(shí)間10s、間歇時(shí)間3s、超聲酶解初始溫度60℃固定的前提下，經(jīng)過(guò)優(yōu)化計(jì)算獲得最優(yōu)酶解條件為:酶解時(shí)間76 min、功率體積密度57 W/L、料液比0.53 g/100mL、

5、酶底比2100 U/g、超聲頻率68±2/33±2 kHz，在此條件下菜籽蛋白水解度DH為17.80％，比對(duì)照提高了近3倍;酶活尚保持在113.32 U/g，是無(wú)超聲對(duì)照組的1.03倍，與酶解前相比活性損失率為77.13％，因此可以固定化酶可以重復(fù)使用。
　　(3)開展了基于固定化酶技術(shù)的菜籽蛋白超聲輔助酶解機(jī)理研究。超聲輔助固定化堿性蛋白酶酶解菜籽蛋白后，酶解上清液和酶解殘?jiān)谋砻媸杷浴€基和二硫鍵含量、紫外光譜、熒光光譜、氨

6、基酸含量、圓二色譜、紅外光譜分析表明，超聲促使了底物蛋白分子螺旋結(jié)構(gòu)伸展，有利于酶解反應(yīng)的發(fā)生。固定化酶的紅外光譜和掃描電鏡分析表明，超聲波使得蛋白酶的分子結(jié)構(gòu)變得更加有序，催化活性和定向性更高;表面更加粗糙，表面積增大，有利于酶與底物的接觸，反應(yīng)速率加快。
　　(4)通過(guò)一種在殼聚糖磁載體上固定堿性蛋白酶的方法得到固定化酶，測(cè)得此固定化酶的操作穩(wěn)定性較好，并用此在超聲場(chǎng)酶解菜籽蛋白，水解度提高25％;在酶解過(guò)程中，超聲波對(duì)底物蛋