體細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞重編程的研究和CRISPr-Cas9技術(shù)在急性早幼粒性白血病中應(yīng)用研究.pdf

1、第一部分、體細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞重編程的研究
　　研究背景和目的:血液系統(tǒng)惡性疾病的治療是世界性難題，化療或放療等手段雖能殺傷腫瘤細(xì)胞，但白血病干細(xì)胞往往逃逸或耐受其作用，重新增殖、分化致疾病復(fù)發(fā)。Lapidot等[1]1994年首次報道了血液惡性疾病中癌癥干細(xì)胞(Cancerstem cells，CSCs)的存在，但迄今為止分選及鑒定CSCs的方法與指標(biāo)卻無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，也無癌癥干細(xì)胞體外建系的報道。2006年Yamanaka等[2]成功

2、自體細(xì)胞獲得誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)，是干細(xì)胞領(lǐng)域的突破性進(jìn)展，開啟通過特定的手段將各種類型細(xì)胞重編程的新時代，包括惡性腫瘤細(xì)胞。使得體外建立惡性腫瘤疾病模型、研究其發(fā)病機(jī)制及藥物篩選等構(gòu)想有了實現(xiàn)的可能。本實驗嘗試對急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系NB4進(jìn)行重編程獲得誘導(dǎo)性多潛能腫瘤細(xì)胞，同時在此過程中學(xué)習(xí)掌握重編程技術(shù)，為研究白血病腫瘤干細(xì)胞提供模型，進(jìn)一步研究其發(fā)病機(jī)

3、制及藥物作用，為有效治療白血病奠定基礎(chǔ)。
　　材料和方法:1）用有效的轉(zhuǎn)染試劑將pMXs質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Plat-E細(xì)胞，包被成攜帶有不同鼠源cDNA（Oct4、Sox2、 Klf4、c-Myc及Zscan4）的逆轉(zhuǎn)錄病毒，收集病毒檢測病毒滴度及感染效率，再感染OG2-MEF細(xì)胞。感染后熒光顯微鏡檢測GFP評估感染效率。將感染細(xì)胞與iMEF細(xì)胞共培養(yǎng)，熒光觀察GFP陽性克隆出現(xiàn)情況，挑出狀態(tài)好的克隆建立小鼠誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(mouse

4、 iPS cells，miPSCs)系。鑒定建系的miPSCs:①熒光觀察GFP陽性克隆形態(tài);②堿性磷酸酶(AP)染色;③核型分析;④畸胎瘤形成;⑤免疫熒光(IF):⑥r(nóng)t-PCR。2)將pMXs質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，包被成攜帶有不同人源cDNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒，同上收集病毒，感染人前皮細(xì)胞(human foreskin cell，HFS)，流式檢測GFP表達(dá)評估效率，重鋪感染后細(xì)胞與HFF-feeder共培養(yǎng)直到出現(xiàn)克隆，挑克隆建系并同

5、上鑒定。3）培養(yǎng)NB4細(xì)胞，同2）中收集病毒原液過濾后懸浮感染NB4細(xì)胞，每24小時一次，共三次。最后一次感染后用流式細(xì)胞術(shù)評估效率。感染細(xì)胞與HFF-feeder共培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，對重編程程度鑒定。
　　結(jié)果:1）OG2-MEF細(xì)胞被攜帶鼠源Yamanaka因子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)及Zscan4的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后，轉(zhuǎn)變成形態(tài)小鼠胚胎干細(xì)胞(mouseembryonic stem cells，mES

6、Cs)類似的細(xì)胞:呈克隆樣生長，細(xì)胞間排列緊密，核質(zhì)比高。對miPSCs進(jìn)行多能性鑒定:①克隆呈GFP陽性，形態(tài)類似mESCs;②AP染色陽性。③核型分析:miPS細(xì)胞染色體數(shù)目正常，為40條。④畸胎瘤實驗:向裸鼠皮下注射miPS細(xì)胞，6-8周形成畸胎瘤，制成石蠟切片經(jīng)HE染色后可見腺體、肌肉、神經(jīng)組織等內(nèi)、中、外胚層的組織。⑤免疫熒光示Nanog及Oct4陽性表達(dá)與mES一致。⑥r(nóng)t-PCR示miPS細(xì)胞與mES均內(nèi)源性表達(dá)Nanog

7、，Oct4及Sox2等基因，而MEF細(xì)胞中無相應(yīng)表達(dá)。2）用攜帶人源Yamanaka因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HFS細(xì)胞并培養(yǎng)，出現(xiàn)形態(tài)與人胚胎干細(xì)胞相似的細(xì)胞:呈克隆性生長，細(xì)胞排列緊密，界限不清，核質(zhì)比高，與飼養(yǎng)層細(xì)胞分界清楚。對hiPSCs進(jìn)行干性鑒定:①AP染色陽性;②核型分析:對hiPSCs進(jìn)行核型分析，大多細(xì)胞染色體數(shù)目正常，為46條。③畸胎瘤實驗:向NOD/SCID小鼠皮下注射hiPS

8、細(xì)胞，8周后形成畸胎瘤，制成石蠟切片經(jīng)HE染色后可見腺體、肌肉、上皮組織等內(nèi)、中、外胚層的組織。④rt-PCR示hiPS細(xì)胞與H19均內(nèi)源性表達(dá)Nanog，Oct4及Sox2等基因，而HFS細(xì)胞中無相應(yīng)表達(dá)。3）收集轉(zhuǎn)染后36h的人源逆轉(zhuǎn)錄病毒原液三輪重復(fù)感染方法感染NB4細(xì)胞;流式檢測GFP表達(dá)，估計病毒感染NB4細(xì)胞的效率約50％。感染后NB4細(xì)胞與HFF-feeder共培養(yǎng)，細(xì)胞出現(xiàn)成簇貼壁，未形成與hES細(xì)胞類似的形態(tài)。對成簇貼

9、壁生長的NB4細(xì)胞進(jìn)行AP染色輕度淡然，rt-PCR檢測Nanog基因表達(dá)水平介于hES與NB4細(xì)胞之間。
　　結(jié)論:1）利用攜帶Yamanaka因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒，能將OG2-MEF細(xì)胞誘導(dǎo)性成多潛能干細(xì)胞，經(jīng)形態(tài)、AP染色、內(nèi)源干性基因表達(dá)、畸胎瘤形成、核型分析及免疫熒光等證實具有mES細(xì)胞相似的生物學(xué)特性。2）用人源Yamanaka因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HFS細(xì)胞，得到人誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(hiPSCs)，經(jīng)形態(tài)、AP染色、內(nèi)源

10、干性基因，核型分析及畸胎瘤形成等證實hiPS細(xì)胞具有hES類似特征。3）病毒原液三次重復(fù)感染NB4細(xì)胞，效率約50％，與HFF-feeder共培養(yǎng)后依據(jù)細(xì)胞形態(tài)、AP染色及基因表達(dá)鑒定，NB4細(xì)胞實現(xiàn)部分重編程。
　　第二部分、CRISPR-Cas9技術(shù)在急性早幼粒性白血病中應(yīng)用研究
　　研究背景與目的:血液系統(tǒng)惡性或遺傳性疾病大多與基因改變有關(guān)系，通過對造血干細(xì)胞突變基因的修復(fù)可能是治愈白血病關(guān)鍵?？茖W(xué)家目前已報道應(yīng)用同源

11、重組、鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)與類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)等技術(shù)在體外動物模型或細(xì)胞中通過基因修復(fù)來治療血液系統(tǒng)遺傳性疾病，但是尚未有在獲得性突變所致惡性血液病中應(yīng)用的報道。2013年研究者報道一種全新的人工核酸內(nèi)切酶CRISPR/Cas9，是一成簇的、規(guī)律間隔的、短回文、重復(fù)序列

12、(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，CRISP)與CRISPR-associated(Cas)9核酸內(nèi)切酶組成，具有高效的基因組編輯功能，已被應(yīng)用于多種生物，包括人、小鼠、大鼠、斑馬魚等的基因編輯，本實驗?zāi)康氖翘剿魍ㄟ^CRISPR/Cas9技術(shù)靶向干擾PML基因的序列，影響PML-RARα融合基因形成，打破其阻滯急性早有粒細(xì)胞的分化來達(dá)到治療疾病的目的。

13、r>　　材料和方法:1）構(gòu)建PX330-mcherry-PML質(zhì)粒:根據(jù)NCBI設(shè)計PML相關(guān)的Oligo，退火后形成短的雙鏈DNA，用T4連接酶將之與BbsI酶切后的PX330-mcherry載體連接。2）將構(gòu)建好的質(zhì)粒用Lipo2000轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)ACS))評估轉(zhuǎn)染效率并分選陽性細(xì)胞培養(yǎng)，提取293T細(xì)胞基因組測序評價所構(gòu)質(zhì)粒的效果。3）將驗證后的質(zhì)粒用核電轉(zhuǎn)染儀轉(zhuǎn)染到NB4細(xì)胞

14、中，而后根據(jù)RFP熒光進(jìn)行FACS分選陽性細(xì)胞培養(yǎng)，2-4天提取DNA測序檢測效果，應(yīng)用瑞氏吉姆薩染色細(xì)胞圖片觀察細(xì)胞分化形態(tài)。
　　結(jié)果:1）成功構(gòu)建PX330-mcherry-PML1、3、5、6四個質(zhì)粒，進(jìn)行大量抽提備用。2）轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞FACS后抽提基因組DNA測序提示PML-1、3、5能成功干擾PML基因序列。3）電轉(zhuǎn)NB4細(xì)胞的效率為30％左右，F(xiàn)ACS后培養(yǎng)2-4天，細(xì)胞死亡較多，提取基因組DNA測序，未測出信號