耐有機(jī)溶劑地衣芽孢桿菌YP1產(chǎn)溶劑穩(wěn)定性蛋白酶的研究.pdf

1、耐有機(jī)溶劑極端微生物在雙相生物催化轉(zhuǎn)化、環(huán)境生物修復(fù)、極端酶系開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域具有重要用途。耐有機(jī)溶劑極端微生物所產(chǎn)生的天然耐有機(jī)溶劑酶系如蛋白酶及酯酶在有機(jī)溶劑中對(duì)某些手性化合物表現(xiàn)出高度的立體選擇性，使它們?cè)谑中曰衔锏牟鸱旨按呋铣傻确矫骘@示出廣闊的應(yīng)用前景。本論文根據(jù)耐有機(jī)溶劑極端菌產(chǎn)生天然耐有機(jī)溶劑酶系的研究現(xiàn)狀，將研究重點(diǎn)放在耐有機(jī)溶劑極端菌的篩選、高強(qiáng)度耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及生物學(xué)特征、耐有機(jī)溶劑蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)及基因表

2、征等研究。本文的主要研究成果如下：
　　 (1)以環(huán)己烷、甲苯、丙酮、丁醇等溶劑為選擇壓力，從土壤樣品中篩選獲得43株耐有機(jī)溶劑菌。經(jīng)鑒定，以環(huán)己烷、甲苯為選擇壓力篩選的36株菌，多為革蘭氏陰性菌Pseudomonas屬細(xì)菌；而由丙酮、丁醇混合溶劑篩選的7株菌均為革蘭氏陽(yáng)性菌株，其中5株為Bacillus屬細(xì)菌。研究了43株候選菌株對(duì)10種溶劑(logP-2.03-5.6)的耐受特性，結(jié)果表明，革蘭氏陰性菌對(duì)溶劑的耐受能力普遍高

3、于革蘭氏陽(yáng)性菌株，以辛醇、十二醇為代表的長(zhǎng)鏈烷醇對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞毒性尤為顯著。43株耐有機(jī)溶劑菌的抗生素耐受性試驗(yàn)顯示了明顯的規(guī)律性，即所有革蘭氏陰性菌對(duì)氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素及氯霉素均不敏感，而革蘭氏陽(yáng)性菌對(duì)上述4種抗生素均敏感，這一現(xiàn)象可能與細(xì)胞壁膜的通透性差別或膜蛋白特性有關(guān)。
　　 (2)從43株耐有機(jī)溶劑極端菌篩選耐有機(jī)溶劑蛋白酶產(chǎn)生菌，獲得8株菌株能相對(duì)高產(chǎn)胞外蛋白酶。其中2菌株所產(chǎn)胞外蛋白酶具有對(duì)高濃度親

4、水溶劑(二甲基亞砜(DMSO)，二甲基甲酰胺(DMF))穩(wěn)定的特質(zhì)，分別為Bacilluslicheniformis YP1和Pseudomonas aeruginosa YYP6，其中Bacillus licheniformisYP1為首次報(bào)道產(chǎn)溶劑穩(wěn)定性蛋白酶的菌株，用于后續(xù)的研究。
　　 (3)溶劑可顯著影響YP1菌株產(chǎn)胞外蛋白酶的能力。烷烴溶劑的碳鏈長(zhǎng)度對(duì)YP1菌株產(chǎn)酶呈現(xiàn)了顯著差異，正庚烷、正辛烷、正癸烷等溶劑顯著抑制

5、YP1產(chǎn)蛋白酶，而十二烷、十四烷、十六烷能顯著促進(jìn)蛋白酶分泌產(chǎn)量提高1倍以上。烷醇均能顯著抑制YP1產(chǎn)胞外蛋白酶，C6以上的烷醇溶劑對(duì)YP1菌株的細(xì)胞毒性顯著高于相應(yīng)的烷烴溶劑。分析十四烷和十二醇對(duì)YP1細(xì)胞形態(tài)的影響可見(jiàn)，十四烷存在下能增加細(xì)胞的比表面積，而十二醇存在下導(dǎo)致了細(xì)胞比表面積的減小，推測(cè)與溶劑的細(xì)胞毒性差異有關(guān)。
　　 (4)分離純化得到電泳純的YP1耐有機(jī)溶劑蛋白酶，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了表征。通過(guò)硫酸銨沉淀、疏水

6、及強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析，得到電泳純的YP1蛋白酶，比活力提高了37.2倍，總蛋白回收率達(dá)20％。分離純化產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)顯示亞基分子質(zhì)量約為28 kDa，以酪蛋白為底物時(shí)，YP1蛋白酶的Km為0.048g/L。純化的YP1蛋白酶對(duì)高達(dá)50％(v/v)濃度的12種有機(jī)溶劑具有高度的穩(wěn)定性，尤其對(duì)親水性溶劑DMF和DMSO的最大耐受濃度分別高達(dá)55％和65％(v/v)，揭示其具有良好的有機(jī)相催化潛力。YP1蛋白酶在p

7、H8.0-13.0內(nèi)的具有較高活力和穩(wěn)定性，最適反應(yīng)pH為10.0，為迄今報(bào)道的最耐堿的溶劑穩(wěn)定性蛋白酶；YP1蛋白酶最適反應(yīng)溫度為55℃，45℃以下時(shí)具有良好的穩(wěn)定性。還原劑對(duì)酶活有輕微的抑制作用，低濃度變性劑尿素(Urea)對(duì)酶活具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。YP1蛋白酶具有絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶的特性，對(duì)表面活性劑Triton、SDS、Tween等均具有較強(qiáng)的抗性。YP1蛋白酶的耐堿特性及對(duì)表面活性劑的抗性，揭示其具有洗滌劑添加領(lǐng)域的應(yīng)用

8、潛力。
　　 (5)克隆了YP1耐有機(jī)溶劑蛋白酶基因，并在Bacillus subtilus WB800中進(jìn)行表達(dá)，驗(yàn)證了表達(dá)蛋白的溶劑耐受性?？寺×税▎?dòng)子、信號(hào)肽的蛋白酶基因，B.licheniformis YP1堿性蛋白酶的閱讀框與B.licheniformis ATCC14580菌株堿性蛋白酶kerA的堿基同源性為96.4％，氨基酸同源性為98.7％，其氨基酸突變位點(diǎn)共有5個(gè)，其中Glu85→Lys85的改變發(fā)生在YP

9、1蛋白酶的前肽序列，成熟蛋白酶的氨基酸變化共有4處，分別為Tyr126→Phe126，Asn199→Ser191，Pro233→Ala233，Ser316→Asn316。采用枯草桿菌克隆載體pHY300PLK，利用YP1蛋白酶自身的啟動(dòng)子、RBS、信號(hào)肽、前肽、成熟肽等功能序列在B.subtilus WB800中進(jìn)行了表達(dá)，重組菌能正確識(shí)別并分泌表達(dá)YP1蛋白酶，培養(yǎng)基上清中蛋白酶活力高達(dá)150U，是含有pHY300PLK空載體對(duì)照菌株