腐生葡萄球菌M36耐有機溶劑脂肪酶基因的克隆與表達.pdf

1、生物柴油是生物質(zhì)能的一種形式，具有綠色、可再生、能耗低等優(yōu)點，能夠緩解石油即將枯竭和環(huán)境污染對人類造成的危機，成為國內(nèi)外重點研究開發(fā)的熱點。與傳統(tǒng)的化學(xué)催化法相比，脂肪酶法合成生物柴油條件溫和、工序簡單、能耗低、綠色環(huán)保。但是由于脂肪酶成本高，有機溶劑對脂肪酶有毒性，脂肪酶具有催化特異性等因素的影響，使酶法生產(chǎn)生物柴油難以有較大的突破和產(chǎn)業(yè)化。本研究主要對耐有機溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌腐生葡萄球菌M36脂肪酶基因lip3進行克隆，并在大腸桿菌和

2、枯草芽孢桿菌中表達：還對lip5基因進行定點突變，以獲得耐有機溶劑的重組脂肪酶。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.腐生葡萄球菌M36脂肪酶基因的克隆。以腐生葡萄球菌M36為出發(fā)菌株。提取總DNA，采用PCR和Sitefinding-PCR的方法分別擴增出741 bp和804 bp的成熟肽基因片段，lip3和lip5，GenBank登錄號分別為：FJ979867和FJ979868。
　　 2.Lip3基因在大腸桿菌中的表達及重

3、組酶性質(zhì)研究。將ltp3基因與大腸桿菌胞內(nèi)表達載體pET-DsbA連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-DsbA-lip3，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中進行表達。經(jīng)過SDS-PAGE電泳、活性染色以及瓊脂顯色平板的檢測證明了lip3的正確表達。優(yōu)化誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，結(jié)果表明：在pH8的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為1.0時，加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L，25℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h，重組酶活力最高達到25.8 U/mL。重組酶BL21/pE

4、T-DsbA-lip3通過Ni柱去除融合蛋白配體得到電泳純的腐生葡萄球菌，lip3脂肪酶蛋白，并研究重組酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：重組酶BL21/pET-lip3最適反應(yīng)pH為8.0，最適反應(yīng)溫度為25℃：對甲醇、正己烷和正庚烷等有機溶劑有較好的耐性：Mg2+和β-巰基乙醇對重組酶有一定的激活作用。
　　 3.Lip3基因在枯草芽孢桿菌中的表達及重組酶性質(zhì)研究。將lip3基因與枯草芽孢桿菌載體pHT43連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pHT43

5、-lip3，電擊轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌DB104內(nèi)，實現(xiàn)了分泌型高效表達。對重組脂肪酶pHT43-lip3酶學(xué)性質(zhì)進行研究，結(jié)果表明：重組酶的最適反應(yīng)pH為8.0，最適反應(yīng)溫度為50℃：在乙醇、異丙醇、丙酮中保存1小時，酶活能保留50％以上，而異戊醇對脂肪酶的活力有提升作用：金屬離子和表面活性劑中，Na+、K+和β-巰基乙醇對重組酶有一定的激活作用。
　　 4.Lip35基因的定點突變及在枯草芽孢桿菌中的表達。應(yīng)用重疊延伸PCR的方

6、法構(gòu)建脂肪酶基因lip35的突變體lip35D93S，并連接枯草芽孢桿菌載體pHT43，在草芽孢桿菌DB104中進行分泌型表達。結(jié)果表明：lip35原始基因一級結(jié)構(gòu)上保守的motifGly-His-Asp-Met-Gly（91～95位），活性中心的Ser變成了Asp，確實是導(dǎo)致其表達沒有活性的原因。對重組酶pHT43-lip5D93S的酶學(xué)性質(zhì)進行研究，結(jié)果表明：最適反應(yīng)溫度為40℃，最適反應(yīng)pH為8.0，在異丙醇、正己烷、正庚烷、丙酮