葡萄內(nèi)生菌中耐有機溶劑脂肪酶菌株的篩選及酶學特性研究.pdf

1、脂肪酶(Lipase, EC3.1.1.3)是分解三脂酰甘油的水解酶類,它不僅能將底物三脂酰甘油水解為丙三醇和脂肪酸,還能催化水解反應的逆反應。近年來,隨著非水相酶學的不斷深入,脂肪酶的應用已超出了油-水界面上進行水解反應的范圍,被廣泛應用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中間體的選擇性保護、高聚物的合成、肽合成等方面,在醫(yī)藥、生物化工、食品等領域具有廣闊的應用前景。微生物脂肪酶具有比動植物脂肪酶更寬的反應pH、適宜溫度范圍和很好的的

2、底物專一性,便于從工業(yè)生產(chǎn)中獲取高純度制劑,是當前工業(yè)用脂肪酶的主要來源,而不同菌種來源的脂肪酶的酶學性質(zhì)和作用機理不同,同時不同菌種所需的營養(yǎng)與培養(yǎng)條件也不同,探討菌種對不同溶劑的敏感性可為研究在有機溶劑中的催化反應奠定基礎。
　　本文針對新疆釀酒葡萄內(nèi)生菌,從中篩選能夠產(chǎn)耐有機溶劑脂肪酶的菌株,確定其分類學地位;優(yōu)化目標菌產(chǎn)耐有機溶劑脂肪酶的發(fā)酵條件,提高菌株產(chǎn)酶能力,并對其粗酶液的酶學特性進行研究。主要結果如下:
　　

3、1.耐有機溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選與鑒定:從已分離出的73株葡萄內(nèi)生菌中,采用羅丹明B平板法初篩得到8株產(chǎn)脂肪酶的內(nèi)生菌,再以1％正庚烷、1%甲苯為篩選壓力,經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)和遺傳穩(wěn)定性研究,確定產(chǎn)耐有機溶劑脂肪酶酶活力最高的1株內(nèi)生菌CJ。通過形態(tài)及26SrDNA-ITS分子生物學技術鑒定,確定該菌株為黑曲霉(Aspergillus niger),構建了系統(tǒng)發(fā)育樹。
　　2.CJ產(chǎn)耐有機溶劑脂肪酶發(fā)酵條件的優(yōu)化:對影響目標菌株產(chǎn)耐有

4、機溶劑脂肪酶的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行了研究,得到最佳的發(fā)酵條件為:乳糖4g、蛋白胨6g、谷物調(diào)和油5ml、MnCl20.1g、pH7、裝液量25%、接種量3%、溫度30℃、轉速150r/min培養(yǎng)72h,此時耐有機溶劑脂肪酶產(chǎn)量可達8.75U/mL。
　　3.CJ產(chǎn)耐有機溶劑脂肪酶的粗酶學特性研究:CJ所產(chǎn)脂肪酶粗酶液的最適反應溫度為40℃,最適反應pH值為7.0;在50℃保溫1h酶活力保留54.55%,具有良好的熱穩(wěn)定性;在pH值

5、3.0~7.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定,有一定的耐酸性。金屬離子Mn2+對酶活力有促進作用,Zn2+、Fe2+、Cu2+對酶活力有抑制作用,K+、Ca2+、Na+、Mg2+對酶活力影響不大。該酶在以葵花油和谷物調(diào)和油為底物時,酶活分別為228%和180%,明顯高于橄欖油和油煙機廢油。在有機溶劑中,該粗酶液的酶活隨著有機溶劑濃度的增加而降低,在10%甲苯和丙酮中的半衰期較長,分別達62.4h和60.8h;在30%、50%的二甲苯中的半衰期都較長;有機