來源于宏基因組耐有機溶劑新酯酶的克隆及酶學性質(zhì)表征.pdf

1、近年來，隨著宏基因組技術(shù)的出現(xiàn)和廣泛使用，顯著拓展了人們對環(huán)境微生物多樣性的認識。宏基因組技術(shù)是指不經(jīng)過微生物培養(yǎng)，直接提取環(huán)境微生物的總基因組的技術(shù)。使用該技術(shù)，對原本在環(huán)境中超過99％的不可培養(yǎng)微生物基因的操作和研究成為了現(xiàn)實，這促使人們發(fā)現(xiàn)了大量具有價值的新的蛋白和活性小分子物質(zhì)。
　　 本課題研究采用宏基因組技術(shù)，針對來源于貴州銅仁梵凈山的土壤微生物樣本，構(gòu)建了一個庫容克隆數(shù)量達到5×104的宏基因組文庫?；谌∷岣视?/p>

2、酯水解生成透明圈的功能篩選方法，從文庫中分離出新酯酶全長基因1條(命名為EstC23)。進化關系分析表明，該酶隸屬于脂肪酶第Ⅳ家族(Hormone-sensitivelipase family，HSL)。對該基因的異源過表達研究表明，該基因在T7強啟動子作用下，產(chǎn)生的可溶性蛋白占細胞總蛋白量的30％左右。純酶蛋白的酶學性質(zhì)表征顯示，EstC23在25℃pH8.0條件下，對pNP-butyrat的酶活達254 U mg-1，該酶的最適反應

3、溫度為40℃，特別是在5-10℃低溫下仍能維持最大活性的50％。EstC23在濃度達50％(V/V)的非極性有機溶劑（高logP）中顯現(xiàn)出極強的穩(wěn)定性，尤其在50％(V/V)的苯類和烷烴類有機溶劑中，其活力能提升至92％至274％之間，孵育一周后酶活性不會降低。同時，酯酶EstC23能水解叔醇酯底物，這是通常的酯酶或脂肪酶不具備的底物活性。這些結(jié)果表明，EstC23在酯合成、手性化合物的拆分、不穩(wěn)定中間體化合物合成、肽合成等方面具有潛在

4、應用價值。
　　 后續(xù)我們以EstC23核酸序列為基礎設計特異性引物，基于宏基因組特異性PCR技術(shù)(Metageno mic Gene Specific PCR，MGS-PCR)和截斷宏基因組特異性PCR技術(shù)(Truncated Metagenomic Gene Specific PCR，TMGS-PCR)，對來自全國不同地域環(huán)境的65組宏基因組DNA進行序列篩選，分別獲得了同源家族全長功能基因7條和核心片段15條，序列分析比對