利用宏基因組技術(shù)克隆和鑒定堆肥環(huán)境中的纖維素酶基因.pdf

1、纖維素的生物降解是一個(gè)有待于解決的難題。作為地球上儲(chǔ)量最高的生物質(zhì)，纖維素的生物降解并被發(fā)酵利用是解決當(dāng)前能源危機(jī)的良方。纖維素具有異于其他生物質(zhì)的致密的晶體結(jié)構(gòu)，這個(gè)結(jié)構(gòu)使纖維素能抵御各種理化作用的侵蝕，也阻礙了對它的降解應(yīng)用。而纖維素的生物降解，一般認(rèn)為，是由一組纖維素酶協(xié)同作用進(jìn)行的，這組酶由外切纖維素酶、內(nèi)切纖維素酶和β—葡萄糖苷酶這三類酶組成。但是人們在利用這組酶進(jìn)行纖維素的實(shí)際水解實(shí)驗(yàn)，卻發(fā)現(xiàn)水解效率很低，人們無法在人工條件

2、下來完全模擬微生物的高效降解纖維素的過程。在目前的知識(shí)水平下，人們還沒有完全理解纖維素酶的水解機(jī)理；另一個(gè)方面，我們通常所認(rèn)為的三個(gè)酶(外切纖維素酶、內(nèi)切纖維素酶、β—葡萄糖苷酶)協(xié)同降解纖維素的理論有待完善。
　　 在本文中，我們利用免培養(yǎng)的宏基因組技術(shù)對堆肥環(huán)境中和纖維素降解有關(guān)的纖維素酶資源進(jìn)行研究，試圖獲知在這樣的環(huán)境中對纖維素降解起主導(dǎo)作用的纖維素酶是什么以及在這樣的環(huán)境中是否存在有特性異于已報(bào)道的纖維素酶。
　

3、　 我們成功地構(gòu)建了一個(gè)好氧堆肥的宏基因組cosmid文庫，文庫有約十萬個(gè)克隆，文庫平均插入片段大小為34 kb，文庫的總?cè)萘繛?.4×109bp。
　　 利用活性篩選法，我們從文庫中獲得四個(gè)表達(dá)纖維素酶活性的克隆，依據(jù)克隆對CMC平板水解圉的大小，這四個(gè)克隆中表達(dá)的纖維素酶由大到小分別是3個(gè)糖基水解酶家族9的纖維素酶和1個(gè)糖基水解酶家族5的纖維素酶。我們選擇了水解圈最大的三個(gè)克隆中的基因進(jìn)行下一步的研究。這三個(gè)基因分別命名為

4、Umcel9A，Umcel9B和Umcel9C。
　　 這三個(gè)基因在核苷酸序列上和GenBank數(shù)據(jù)庫里的任何序列都沒有同源性。這三個(gè)基因編碼的產(chǎn)物Umcel9A、Umcel9B和Umcel9C都為具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(ig-like domain和catalytic domain)的糖基水解酶家族九的纖維素內(nèi)切酶。從BlastX的結(jié)果來看，Umcel9A和來自Cellvibrio japonicus的Cel9B同源性最高(Ident

5、ities69％。Positives81％)；Umcel9B也是和來自Cellvibrio japonicus的Cel9B同源性最高(Identities51％，Positives67％)；Umcel9C和來自Xanthomonas campestris pv.campestris str.ATCC33913的EGL2有最高的相似性(Identities58％，Positives71％)。
　　 在進(jìn)化樹分析中，這三個(gè)酶和來自X

6、anthomonas campestris pv.Campestris、Fibrobacter succinogene、Cytophaga hutchinosonii以及白蟻腸道宏基因組的纖維素酶歸到了一個(gè)分支上，它們具有類似的蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)。
　　 但是Umcel9A、Umcel9B和Umcel9C并不是來自同一個(gè)基因的拷貝復(fù)制，它們是由不同基因的趨同進(jìn)化得到的。Umcel9C的基因的GC含量高達(dá)71％，明顯異于Umcel9

7、A和Umcel9B的55％，而Umcel9B是個(gè)多聚體的蛋白質(zhì)這點(diǎn)又異于Umcel9A。
　　 Umcel9A、Umcel9B和Umcel9C都是屬于中溫、pH中性作用的纖維素內(nèi)切酶，不具有processive活性。但是卻可以把非結(jié)晶纖維素直接水解成纖維二糖和葡萄糖，并以纖維二糖為主要產(chǎn)物。這樣的水解纖維素特性和普通的纖維素內(nèi)切酶把纖維素水解成寡糖鏈的特性差異極大。這樣的酶在已報(bào)道的文獻(xiàn)中只發(fā)現(xiàn)有Trichoderma rees

8、ei的Cel7B和Thermobifida fusca的E1。而在和我們克隆的三個(gè)酶在同一個(gè)進(jìn)化樹分支上的酶中有Fibrobacter Succinogene的內(nèi)切酶，這個(gè)酶在文獻(xiàn)中被報(bào)道它的特性也是類似的產(chǎn)生單糖和二糖，但是以單糖為主要產(chǎn)物。
　　 結(jié)論：我們利用宏基因組技術(shù)研究堆肥環(huán)境中的纖維素酶。在我們構(gòu)建的DNA文庫中獲得了相似的一類纖維素內(nèi)切酶。這些纖維素酶的核苷酸序列差異極大但是由趨同進(jìn)化產(chǎn)生的具有相似結(jié)構(gòu)和功能的酶