羅格列酮對大鼠腹主動脈球囊損傷后再狹窄的影響及機(jī)制.pdf

1、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈血管成形術(shù)(Percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty，PTCA)應(yīng)用于臨床以來，取得了顯著的療效，已成為治療冠心病的重要手段。隨著操作技術(shù)的不斷完善和術(shù)者經(jīng)驗的積累，PTCA的成功率不斷提高，但PTCA術(shù)后再狹窄(Restenosis，RS)的發(fā)生仍是影響遠(yuǎn)期效果的主要因素，嚴(yán)重制約了該治療手段的推廣應(yīng)用。大量基礎(chǔ)和臨床研究表明，血管再狹窄的過程實質(zhì)上是機(jī)體對損傷的修復(fù)反應(yīng)過

2、程，多種因素參與了RS的形成。關(guān)于再狹窄發(fā)生的確切機(jī)制目前還不完全明了，盡管基礎(chǔ)及臨床工作在此方面進(jìn)行了大量的研究，抗血小板藥物的應(yīng)用、藥物支架的植入明顯地降低了再狹窄的發(fā)生率，但目前仍未找到一種安全有效、用藥簡便、能作用于多種病理環(huán)節(jié)的防治再狹窄的藥物。 球囊損傷后再狹窄是多種因素引起血管平滑肌細(xì)(Vascularsmoothmusclecell，VSMC)增殖、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)堆積

3、及血管重塑的共同結(jié)果。內(nèi)膜增生中的ECM是由VSMC遷移至內(nèi)膜后合成分泌的，而VSMC的遷移與基質(zhì)金屬蛋白酶有關(guān)。在血管損傷后再狹窄形成過程中，多種活性物質(zhì)和生長因子釋放，通過特異性受體，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)信號傳遞途徑激活轉(zhuǎn)錄因子，啟動特定核內(nèi)基因的表達(dá)而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。既往研究顯示細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignalregulatedkinase，ERK)信號通路是多數(shù)生長因子、細(xì)胞因子調(diào)控靶細(xì)胞增殖的重要途徑，ERK的活

4、化是球囊損傷后血管再狹窄的關(guān)鍵因素之一。TGFβ/smad通路具有參與細(xì)胞的生長分化、組織器官的胚胎發(fā)育、損傷的修復(fù)等多種生物學(xué)效應(yīng)，特別是在器官膠原蛋白的表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)的聚集和降解中起重要作用。因此干預(yù)ERK信號通路和TGFβ/smad通路有可能成為防治再狹窄的靶點。 羅格列酮屬于胰島素增敏劑噻唑烷二酮類(Thiazolidinediones，TZDs)藥物，近年來，隨著對這類藥物作用機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)這類藥物是過氧化物酶體增殖

5、物激活型受體(Peroxisomeproliferatoractivatedrceptor，PPAR)γ的高親和性配體。研究發(fā)現(xiàn)PPARγ配體不僅可以改善胰島素抵抗綜合征，還可以降低培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞血管細(xì)胞黏附分子-1的表達(dá)，改善內(nèi)皮細(xì)胞的黏附功能；PPARγ激動劑可抑制體外VSMC增殖；通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloprotease，MMP)-9的表達(dá)而抑制平滑肌細(xì)胞遷移；抑制炎癥穩(wěn)定斑塊。上述這些改變又與動脈粥樣硬

6、化血管成形術(shù)后再狹窄有關(guān)，提示羅格列酮可能成為多途徑防治再狹窄的藥物。目前羅格列酮對血管損傷后再狹窄過程中TGFβ1/Smad3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)表達(dá)的影響在體研究未見報道。本課題將以球囊損傷建立大鼠動脈損傷后再狹窄模型，在體情況下觀察PPARγ激動劑羅格列酮對血管損傷后再狹窄的作用，并觀察羅格列酮對血管損傷后MMP-9、TGFβ1/smad3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)在血管中表達(dá)的影

7、響，探討RSG防治血管損傷后再狹窄的機(jī)制，為再狹窄治療尋找新的治療靶點。 材料與方法： 一、動物模型 1.實驗動物及分組：健康雄性Wistar大鼠，體重300g～350g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。隨機(jī)分為3組。治療組(n=30)：球囊損傷加羅格列酮(rosiglitazone，RSG)5mg·kg-1·d-1干預(yù)；損傷組(n=30)：球囊損傷組；假手術(shù)組對照組(n=30)。每組分為1、3、7、14、28天

8、5個時點，每個時點6只大鼠。 2.RS模型的建立：將2.5×20mmPTCA球囊導(dǎo)管沿左頸總動脈送至腹主動脈，以6kPa的壓力充盈球囊后回拉至切口處以剝脫主動脈內(nèi)皮，抽至負(fù)壓后再次送入球囊，重復(fù)以上操作，共3次。 3.取材各組分別于術(shù)后既定時點處死大鼠，10％水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉，快速摘取腹主動脈，把管腔內(nèi)血液用生理鹽水沖洗，將腹主動脈分段分別置于4％多聚甲醛液固定備用及液氮冷凍后于-70℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

9、 二、實驗方法及檢測指標(biāo) 1.形態(tài)學(xué)指標(biāo)：通過光鏡觀察血管損傷后的病理變化及羅格列酮對其影響。計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測量內(nèi)膜和中膜厚度及面積、管腔面積、內(nèi)彈力膜(IELA)面積、外彈力膜(EELA)面積。 2.免疫組化檢測血管損傷后MMP-9、PCNA、膠原在血管壁的表達(dá)及羅格列酮對其影響。 3.RT-PCR技術(shù)測定血管損傷后PPARγ、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、轉(zhuǎn)化生長因子β1mRNA表達(dá)。 4.Weste

10、rnblotting技術(shù)檢測損傷血管中轉(zhuǎn)化生長因子β1、磷酸化smad3蛋白、磷酸化ERK1/2、磷酸化STAT3的表達(dá)。 三、統(tǒng)計學(xué)分析和處理：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)均以(-x)±s表示，組間比較采用單因素方差分析(OneWayANOVA)。 結(jié)果： 一、大鼠腹主動脈球囊損傷后膠原和基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)及羅格列酮對其影響 1.大鼠腹主動脈PTA后新生內(nèi)膜3天開始出現(xiàn)，7天開始增厚，1

11、4至28天內(nèi)膜厚度逐漸增加，損傷組各時點之間比較P＜0.01。球囊損傷后7天新生內(nèi)膜面積開始增加，并逐漸增大，14～28天管腔明顯狹窄；RSG治療使新生內(nèi)膜厚度、面積明顯減小(P＜0.01)，28天時新生內(nèi)膜面積減少23.5％，管腔面積比損傷組增加18.8％。 2.球囊損傷7天后內(nèi)膜中膠原的表達(dá)逐漸增加，28天最高，損傷后3天膠原在中膜的表達(dá)開始增加，7天達(dá)高峰，RSG可降低內(nèi)膜、中膜膠原的表達(dá)。 3.大鼠球囊損傷后血管

12、中膜MMP-9蛋白表達(dá)上調(diào)，3～7天達(dá)高峰，14～28天明顯下降接近于正常；內(nèi)膜MMP-9蛋白表達(dá)7天達(dá)高峰，14～28天逐漸下降。與損傷組相比，RSG治療使內(nèi)膜、中膜MMP-9的表達(dá)下調(diào)。 4.相關(guān)分析表明，內(nèi)膜及中膜MMP-9的表達(dá)與PCNA的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.928、0.866，P＜0.01。 二、TGFβ1/smad3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在球囊損傷后再狹窄中的表達(dá)及羅格列酮對其影響 1.與假手術(shù)

13、組相比，損傷組血管TGFβ1mRNA表達(dá)術(shù)后3天開始增高，隨時間延長表達(dá)水平逐漸升高，14天達(dá)高峰。RSG治療組與此趨勢相同，但RSG治療使損傷后TGFβ1mRNA表達(dá)水平降低。 2.對照組TGFβ1蛋白表達(dá)量很低，與對照組相比，損傷組術(shù)后7天TGFβ1蛋白表達(dá)明顯增加，14天達(dá)高峰，28天明顯下降。RSG治療使損傷后血管TGFβ1蛋白表達(dá)量有所下降。 3.對照組smad3蛋白表達(dá)量很低，損傷組術(shù)后7天smad3蛋白表達(dá)

14、明顯增加，14天達(dá)高峰，28天稍有下降。RSG治療使損傷后血管smad3蛋白表達(dá)量下降。 4.PPARγmRNA在對照組正常血管中幾乎不表達(dá)，損傷后3天PPARγ的表達(dá)增高，7天達(dá)高峰，14～28天逐漸下降；RSG治療使血管損傷后PPARγmRNA的表達(dá)水平較損傷組下降。 5.TGFβ1mRNA表達(dá)與管腔面積呈明顯負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)是-0.719，p＜0.01。TGFβ1蛋白的表達(dá)與新生內(nèi)膜厚度呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)是0.

15、560，p＜0.01。 三、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶在血管損傷后再狹窄中的表達(dá)及羅格列酮對其影響 1.損傷組術(shù)后3天p-ERK1/2蛋白表達(dá)開始增加，7天達(dá)高峰，14～28天稍有下降。RSG治療使損傷后血管p-ERK1/2蛋白表達(dá)量有所下降，7天高峰p-ERK1表達(dá)量治療組較損傷組下降15.9％，p-ERK2治療組較損傷組下降7.7％P＜0.01。 2.損傷組術(shù)后3天p-STAT3蛋白表達(dá)稍有增加，7天時表達(dá)明顯，14

16、-28天逐漸下降。RSG治療使損傷后血管p-STAT3蛋白表達(dá)量有所下降，7天時抑制最明顯，P＜0.01。 3.大鼠球囊損傷后血管MMP-9mRNA表達(dá)上調(diào)，7天達(dá)高峰，14天開始下降，28天明顯下降接近于正常。與損傷組相比，RSG治療使MMP-9的表達(dá)下調(diào)，P＜0.05。 4.血管p-ERK蛋白的表達(dá)與p-STAT3蛋白、MMP-9mRNA表達(dá)的時相一致；p-ERK與內(nèi)膜PCNA表達(dá)的相關(guān)系數(shù)是0.929，P＜0.01

17、，與中膜PCNA表達(dá)的相關(guān)系數(shù)是0.338，P＜0.01；p-ERK1和p-ERK2蛋白的表達(dá)與p-STAT3蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.873、0.875，P＜0.01。 結(jié)論： 1.MMP-9參與再狹窄形成的機(jī)制主要與其促進(jìn)VSMC向內(nèi)膜的增殖、移行有關(guān)。 2.RSG有減輕血管損傷后內(nèi)膜增殖、再狹窄的作用，其機(jī)制可能與降低血管損傷后MMP-9的表達(dá)，抑制VSMC的移行、增殖及細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生有關(guān)。