脂聯(lián)素與兔髂動脈球囊損傷后內(nèi)膜增殖的關(guān)系及羅格列酮的干預(yù)作用.pdf

1、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)（percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）是近年來治療冠狀動脈狹窄的理想手段，但術(shù)后較高的再狹窄發(fā)生率嚴(yán)重影響了其遠(yuǎn)期療效，給病人乃至社會造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。但PTCA術(shù)后再狹窄發(fā)生的具體機(jī)制，迄今仍原理不明。脂聯(lián)素（adiponectin，APN）是新近發(fā)現(xiàn)的一種功能多樣的脂肪因子，已被證實(shí)有抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗炎、胰島素增敏等方面的作用，但

2、其在預(yù)防PTCA術(shù)后再狹窄中的作用尚不明了。 現(xiàn)有研究結(jié)果表明，APN在體內(nèi)的表達(dá)受多種因素調(diào)節(jié)，噻唑烷二酮類（thiazolidinedions，TZDs）藥物是就是其中比較典型的一種，它能通過激動特異性的過氧化物酶體增殖物活化受體（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR）γ來增加體內(nèi)APN的表達(dá)水平。TZDs類藥物羅格列酮可通過與體內(nèi)受體結(jié)合后激活，從而明顯改善Ⅱ型糖尿

3、病患者的胰島素抵抗、高胰島素血癥和高糖血癥代謝紊亂，與此同時，此類藥物在降血壓、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制炎癥反應(yīng)、抗動脈粥樣硬化以及對腎臟的保護(hù)方面也顯示了較好的作用。對其在減輕血管內(nèi)皮損傷后再狹窄方面的作用進(jìn)行深入的研究并明確其與APN等脂肪因子之間的聯(lián)系，將有利于指導(dǎo)我們的臨床工作，為解決再狹窄這一難題提供新的思路，并將為糖尿病、脂肪代謝紊亂、心血管疾病之間的聯(lián)系提供新的證據(jù)。 目的: 1、觀察APN與兔髂動脈球囊內(nèi)膜損傷

4、術(shù)后血管內(nèi)膜增殖水平及超敏C反應(yīng)蛋白（high-sensitivity C-responsibility protein，hs-CRP）等心血管炎性標(biāo)志物表達(dá)的關(guān)系，并進(jìn)行相關(guān)性分析以明確APN在血管內(nèi)膜損傷術(shù)后再狹窄中所起的作用。 2、明確特異性的PPAR-γ激動劑羅格列酮是否可以通過提高兔體內(nèi)APN的表達(dá)水平等途徑保護(hù)受損的血管內(nèi)皮，抑制血管內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞的過度增殖，探討羅格列酮參與血管再狹窄的可能機(jī)制。 3、了解羅

5、格列酮對實(shí)驗(yàn)兔高脂飲食加髂動脈血管內(nèi)膜剝脫術(shù)后血糖、血脂及hs-CRP等指標(biāo)的影響。 方法: 1、實(shí)驗(yàn)動物的選取及分組3月齡的健康雄性新西蘭大耳白兔30只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組各10只，即假手術(shù)對照組（給予普通飲食+單純右側(cè)股動脈結(jié)扎術(shù)）、模型組（給予高脂飲食+球囊內(nèi)膜剝脫術(shù)）和羅格列酮組（給予高脂飲食+球囊內(nèi)膜剝脫術(shù)+羅格列酮）。后兩組首先給予高脂飼料（普通飼料中加入1%膽固醇、7．5%蛋黃粉和8%豬油）喂養(yǎng)8

6、周后，行右側(cè)髂動脈球囊內(nèi)膜剝脫手術(shù)。 2、髂動脈球囊內(nèi)膜損傷模型的建立速麻安（0．1-0．15ml/kg）肌肉注射進(jìn)行麻醉，常規(guī)備皮，消毒鋪巾，于右側(cè)大腿內(nèi)側(cè)膝上股動脈搏動最明顯處縱行切開皮膚，鈍性分離皮下組織及肌肉，游離股動脈2-3cm，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，近心端用無創(chuàng)血管夾暫時夾閉。用眼科剪在結(jié)扎動脈稍上方作一個約45°的切口，切口勿大于血管管徑的1/2，直接插入動脈導(dǎo)管鞘，依次送入導(dǎo)絲針和軟頭導(dǎo)絲，沿導(dǎo)絲送入2．5F冠狀動脈球囊導(dǎo)

7、管，深度約12-15cm，達(dá)髂動脈分叉水平，以8個大氣壓充盈球囊，將充氣球囊沿髂動脈上下牽拉5-8cm至股動脈近端，反復(fù)3次，充分剝離髂動脈內(nèi)膜，然后抽空球囊移出導(dǎo)管，結(jié)扎血管，分層縫合切口。術(shù)后肌注青霉素80萬單位抗感染，連續(xù)3天。羅格列酮組從實(shí)驗(yàn)前3天開始增加羅格列酮0．5mg/kg/d，混在第1口飼料中給藥。 3、血清標(biāo)本指標(biāo)檢測分別于實(shí)驗(yàn)初和手術(shù)后第1、4周末經(jīng)耳緣靜脈采血，標(biāo)本采集前實(shí)驗(yàn)動物禁食8小時，標(biāo)本收集后立即送

8、本院檢驗(yàn)科，使用全自動生化測定儀檢測血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、血糖（FPG）和超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）的含量。同時用ELISA法測定血漿中脂聯(lián)素的表達(dá)水平，具體操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。 4、組織學(xué)分析分別于術(shù)后第1、4周末隨機(jī)采用空氣栓塞法處死各組實(shí)驗(yàn)動物各5只，剖開腹腔，游離腹主動脈并逆行分離至髂總動脈，插管用生理鹽水灌洗腹-髂動脈。

9、以左、右髂動脈分叉點(diǎn)為參照，留取病理標(biāo)本各1～2cm，放入10%中性甲醛中固定，制作石蠟切片，行HE染色及彈力纖維染色。每個標(biāo)本隨機(jī)選取5個視野，應(yīng)用高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)測定血管新生內(nèi)膜面積（IA）、中膜面積（MA），并計(jì)算內(nèi)膜增殖指數(shù)，內(nèi)膜增殖指數(shù)=IA/（IA+MA）。行免疫組化染色檢測增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)，具體檢測步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。陽性著色均表現(xiàn)為胞核成棕黃色，隨機(jī)選取5個視野，計(jì)算陽性表達(dá)率（陽性細(xì)胞數(shù)

10、/觀察細(xì)胞總數(shù)，%）。 5、凋亡細(xì)胞結(jié)果檢測根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明，鏡下觀察著色的陽性細(xì)胞，每張切片取5個視野（×400），計(jì)數(shù)正常細(xì)胞和陽性細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率=平均陽性染色細(xì)胞核數(shù)/所有細(xì)胞核數(shù)×100%。 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理以SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，計(jì)量資料用X±S表示，兩組資料間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間差異的顯著性分析用方差分析，P<0．05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。制表、攝片描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 結(jié)果:

11、 1、羅格列酮對血脂及APN表達(dá)的影響各組血脂、血糖的基礎(chǔ)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≥0．05）。術(shù)后第1周、4周末模型組和羅格列酮組兔血清TC、TG、LDL-C和hs-CRP的水平均顯著高于正常對照組（P<0．01或P<0．05）。羅格列酮組較模型組上述指標(biāo)顯著下降（術(shù)后l周末時TC：P=0．000、TG：P=0．028、LDL-C：P=0．000；術(shù)后4周末時TC：P=0．001、TG：P=0．001、LDL-C：P=0．00

12、0），但各組間HDL-C的變化不明顯，血糖的差異無顯著性（P>0．05）。正常對照組、模型組和羅格列酮組血漿APN的基礎(chǔ)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（依次為2．29±0．23、2．32±0．28和2．35±0．36ug/ml，P>0．05），術(shù)后1周末模型組及羅格列酮組APN水平均有所降低，模型組下降更為顯著，但兩組間的差別不顯著（分別為1．44±0．31和1．62±0．63ug/ml，P=0，191）；第4周末，模型組APN的水平繼續(xù)下降，而羅格

13、列酮組則有所回升，兩組相比差異有顯著性（分別為1．17±0．33和1．85±0．16 ug/ml，P=0．01），提示羅格列酮干預(yù)4周可以顯著提高兔體內(nèi)APN的表達(dá)水平。 2、APN與球囊損傷后兔血管內(nèi)膜增殖水平的關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高脂飲食加髂動脈球囊內(nèi)膜損傷術(shù)后，隨著血清TC、TG和LDL-C水平的增高，APN的表達(dá)水平是顯著降低的，APN水平與血管內(nèi)膜的增值指數(shù)IHI呈顯著的負(fù)相關(guān)，以術(shù)后4周末更為顯著（r=-0．733，P

14、=0．002），與血管炎性指標(biāo)hs-CRP呈顯著的負(fù)相關(guān)（r=-0．860，P=0．000），提示APN參與了模型組動物的血脂代謝紊亂及內(nèi)膜增殖等病理生理過程。 3、血管形態(tài)學(xué)改變：HE染色及彈力纖維染色可見對照組血管內(nèi)膜光滑，中膜平滑肌細(xì)胞環(huán)繞管腔排列規(guī)則；模型組內(nèi)膜明顯增厚，管腔狹窄，內(nèi)膜及中膜下平滑肌細(xì)胞增生且不規(guī)則，彈力纖維層增粗、紊亂，斑塊隆起明顯，可見大量泡沫細(xì)胞浸潤。以上病理變化術(shù)后4周末較1周末更為顯著。羅格列酮

15、組內(nèi)膜、中膜亦有不同程度的增厚，管腔有一定狹窄，但狹窄程度同模型組相比差異有顯著性（P<0．01或P<0．05）。 4、PCNA表達(dá)的免疫組化染色及細(xì)胞凋亡檢測染色結(jié)果顯示，PCNA陽性表達(dá)細(xì)胞胞核呈棕黃色，主要集中在新生內(nèi)膜中。對照組少見PCNA的陽性表達(dá)，而模型組與羅格列酮干預(yù)組均可見PCNA有不同程度的表達(dá)。與模型組相比，羅格列酮干預(yù)后PCNA表達(dá)明顯下降（術(shù)后1周末P=0．000，術(shù)后4周末P=0．000）。凋亡細(xì)胞的核

16、為棕褐色，正常對照組少見凋亡細(xì)胞，球囊損傷后細(xì)胞凋亡增多，成散在分布，以增生的血管內(nèi)膜多見。羅格列酮干預(yù)后細(xì)胞凋亡數(shù)目較模型組明顯增多，1、4周末模型組與羅格列酮組分別為21．84±3．22比36．25±3．79，P=0．000；18．64±1．28比24．79±2．48，P=0．000），隨著時間的延長，術(shù)后4周末較1周末細(xì)胞凋亡程度有減輕的趨勢。 結(jié)論: 兔髂動脈球囊損傷后血漿脂聯(lián)素的水平與內(nèi)膜增殖程度呈顯著的負(fù)相關(guān)