豬PMAP-23單克隆抗體的制備及乳鐵蛋白對(duì)PMAP-23分泌表達(dá)的影響.pdf

1、本研究利用豬抗菌肽PMAP-23的氨基酸片段,應(yīng)用雜交瘤技術(shù)成功制備了抗天然抗菌肽PMAP-23單克隆抗體。然后利用制備的單克隆抗體建立抑制酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)方法,在翻譯水平上研究了乳鐵蛋白對(duì)豬抗菌肽PMAP-23基因分泌表達(dá)的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.利用碳化二亞胺法將人工合成的PMAP-23(RIIDLLWRVRRPQKPKFVTVWVR)的氨基酸片段與卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)

2、制備人工免疫原PMAP-23-OVA和包被原PMAP-23-BSA,應(yīng)用雜交瘤技術(shù)成功制備了兩株能穩(wěn)定分泌PMAP-23單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2E4和3C1。將獲得的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng),通過(guò)腹腔注射注入BALB/C小鼠體內(nèi),制備PMAP-23的單克隆抗體腹水,并應(yīng)用辛酸-硫酸銨鹽析法純化腹水得到純度較高的單克隆抗體。
　　 2.對(duì)純化的單克隆抗體進(jìn)行相關(guān)性質(zhì)初步鑒定。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),骨髓細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)PMAP-23單克隆抗

3、體具有明顯的抑制效果,說(shuō)明PMAP-23是豬骨髓源性抗菌肽,且制備的PMAP-23單克隆抗體是天然抗菌肽PMAP-23的單克隆抗體;所得單克隆抗體濃度高于10.0 mg/mL;間接ELISA測(cè)定其效價(jià)在1:2.5×105以上;其中2E4細(xì)胞株分泌的單克隆抗體效價(jià)更高,其最佳工作濃度為稀釋4.1×105倍;制備的單克隆抗體特異性強(qiáng),與其他抗菌肽無(wú)交叉反應(yīng);雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)得制備的單克隆抗體為IgG1亞類。
　　 3.本試驗(yàn)利用制

4、備的抗菌肽PMAP-23單克隆抗體和雜交瘤技術(shù)篩選并建立了3株能分泌抗菌肽PMAP-23的細(xì)胞株,分別命名為1E7、282和285。該細(xì)胞株培養(yǎng)上清中抗菌肽PMAP-23的含量與對(duì)照組小鼠骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗菌肽含量相比,差異均極顯著(P＜0.01)。該細(xì)胞株的建立為抗菌肽PMAP-23相關(guān)性質(zhì)的研究奠定了基礎(chǔ)。同時(shí),本試驗(yàn)的研究方法和思路也為其他小分子肽類物質(zhì)的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 4.從30日齡斷奶杜長(zhǎng)大仔豬的股骨抽取并

5、分離骨髓細(xì)胞,進(jìn)行體外培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,分別以10μg/mL、100μg/mL、1000μg/mL的乳鐵蛋白處理細(xì)胞,空白對(duì)照孔用等量的RPMI1640培養(yǎng)液代替,繼續(xù)培養(yǎng)3 h,6 h,12 h和24 h,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)試驗(yàn)孔設(shè)3個(gè)重復(fù)。將每個(gè)試驗(yàn)孔的細(xì)胞培養(yǎng)液離心取上清,應(yīng)用制備的PMAP-23特異性單克隆抗體建立抑制ELISA,在翻譯水平上研究不同濃度乳鐵蛋白不同作用時(shí)間對(duì)豬抗菌肽PMAP-23基因分泌表達(dá)的影響。結(jié)果表明