金蟬花抗衰老及抗氧化活性初步研究.pdf

1、金蟬花為麥角菌科真菌大蟬草（Cordyceps cicadae Shing）及其寄主山蟬(Cicadaflammata Dist)若蟲(chóng)形成的干燥復(fù)合體，其性味甘寒，具散風(fēng)熱，定驚鎮(zhèn)痙作用，與冬蟲(chóng)夏草的無(wú)性型同屬，功效相近。近年來(lái)藥理研究表明，金蟬花具有抗衰老和抗氧化的作用，但對(duì)其系統(tǒng)研究還不夠深入。本論文系統(tǒng)地研究了金蟬花水提物中多糖及各萃取部位的抗氧化抗衰老活性及作用機(jī)制，采用LC-ESI-MSn法初步解析活性部位的物質(zhì)基礎(chǔ)，并運(yùn)用現(xiàn)

2、代色譜分析方法和化學(xué)方法對(duì)活性多糖進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析，為該真菌藥材深入開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下:
　　1.金蟬花各部位抗氧化活性研究。采用DPPH自由基清除能力測(cè)定、·OH自由基清除能力測(cè)定、O2·-自由基清除能力測(cè)定、還原力性能測(cè)定和總抗氧化性能測(cè)定法，研究金蟬花各部位體外的抗氧化活性。結(jié)果表明，金蟬花各部位抗氧化活性為正丁醇部位＞多糖＞水提物＞剩余水部位＞乙酸乙酯部位。在清除自由基體系中，正丁醇部位和多糖清除自由基

3、能力相對(duì)較強(qiáng)，其IC50值僅次于Vc對(duì)照組，表明正丁醇部位和多糖能抑制自由基對(duì)機(jī)體的損傷，具有一定的抗氧化和抗衰老的作用。
　　2.金蟬花各部位對(duì)谷氨酸(Glu)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞衰老的保護(hù)作用及機(jī)理研究。采用Glu(13mmol/L)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷衰老模型，研究金蟬花各部位的抗衰老活性。發(fā)現(xiàn)金蟬花各部位劑量依耐性的抑制Glu對(duì)PC12細(xì)胞的衰老作用，其中，金蟬花正丁醇部位抑制細(xì)胞衰老作用明顯優(yōu)于其它部位，多糖次之。在此基礎(chǔ)

4、上，進(jìn)一步研究了金蟬花正丁醇部位抑制細(xì)胞衰老的作用機(jī)制。發(fā)現(xiàn)金蟬花正丁醇部位可明顯抑制谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量;阻止細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放，提高細(xì)胞的存活率;并且能穩(wěn)定線粒體膜電位，對(duì)抗Glu誘導(dǎo)的膜電位下降;同時(shí)能降低細(xì)胞內(nèi)的氧自由基水平(ROS)，提高谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。表明金蟬花提取物的活性部位對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞衰老有保護(hù)作用，其作

5、用機(jī)制可能與穩(wěn)定細(xì)胞線粒體跨膜電位，減少ROS的生成，阻止氧化應(yīng)激的發(fā)生，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bcl-2蛋白的表達(dá)有關(guān)。
　　3.金蟬花活性部位的成分分析及主要成分含量測(cè)定。采用LC-ESI-MSn聯(lián)用分析方法對(duì)金蟬花正丁醇活性部位的主要化學(xué)成分進(jìn)行了分析，結(jié)合質(zhì)譜斷裂數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)中已知化合物進(jìn)行對(duì)照解析，初步推斷了正丁醇部位中的主要的8個(gè)化合物:蟲(chóng)草素，N6-(2-羥乙基)腺苷，腺苷，鳥(niǎo)苷，尿苷，N6-(2-羥乙基)腺嘌呤，鳥(niǎo)嘌呤

6、，次黃嘌呤。在LC-ESI-MSn聯(lián)用分析正丁醇部位中活性成分的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定了正丁醇部位中主要活性成分腺苷、蟲(chóng)草素、鳥(niǎo)苷和尿苷的含量，流動(dòng)相:A為甲醇，B為0.1％甲酸水溶液，進(jìn)行梯度洗脫，流速:1 mL·min-1;進(jìn)樣量:10μL;檢測(cè)波長(zhǎng):267 nm;柱溫:30℃，該法簡(jiǎn)單方便，分離效果好。金蟬花正丁醇部位中腺苷、蟲(chóng)草素、鳥(niǎo)苷和尿苷含量分別為8.485 mg/g、7.028 mg/g、7.909 mg/g、

7、8.176 mg/g。該研究初步揭示了金蟬花正丁醇部位抗衰老和抗氧化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，表明正丁醇部位活性物質(zhì)主要為核苷類化合物，測(cè)定了主要活性成分腺苷、蟲(chóng)草素、鳥(niǎo)苷和尿苷的含量，為該部位藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中的給藥劑量提供了依據(jù)。
　　4.金蟬花多糖的提取純化工藝研究。采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化金蟬花多糖的最佳提取工藝。該工藝為提取溫度88℃，提取時(shí)間97min，料液比1∶23，提取2次，金蟬花多糖平均提取得率為6.787％。采用水

8、提醇沉法從金蟬花中提取水溶性粗多糖CPS，Sevag法去除蛋白質(zhì)，活性炭吸附脫色，CPS從深黃色脫至淡黃色;CPS經(jīng)DEAE-纖維素柱層析和Sephadex G-100凝膠柱層析進(jìn)一步純化，得到PSA-2和PSD-1二種多糖組分。采用高效液相色譜法對(duì)PSA-2和PSD-1二個(gè)多糖組分進(jìn)行純度檢測(cè)，PSA-2和PSD-1在HPLC圖譜上均呈單一對(duì)稱峰，表明兩種組分均達(dá)到了一定的均一純度。
　　5.PSA-2和PSD-1的組成分析、理

9、化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)研究。采用薄層層析法和氣相色譜分析法對(duì)PSA-2和PSD-1二個(gè)多糖組分進(jìn)行單糖組分分析，得出PSA-2主要由D-葡萄糖、D-木糖和少量的L-鼠李糖組成，其摩爾比為19.04∶8.73∶1.00; PSD-1由D-葡萄糖和L-鼠李糖組成，其摩爾比為1.67∶1.00。采用改良的硫酸-苯酚法和咔唑硫酸比色法，測(cè)定了PSA-2和PSD-1二個(gè)多糖組分糖和糖醛酸含量，得出PSA-2組分含糖量為78.80％，糖醛酸含量為3.81

10、％; PSD-1組分含糖量為71.92％，糖醛酸含量為2.56％。采用UV、IR、GC、HPLC、高碘酸氧化和Smith降解等現(xiàn)代分析手段，對(duì)PSA-2和PSD-1的理化特性及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行了研究。理化性質(zhì)研究表明，PSA-2和PSD-1均為白色絮狀固體;兩者均不含淀粉，氨基酸和蛋白質(zhì);兩者均易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑;兩者無(wú)甜味，無(wú)揮發(fā)性，水溶液透明;PSA-2的比旋光度[α]20℃D=131.48°±0.86°，PSD-1的比旋光度[α