新型重組新城疫病毒(NDV)表達系統(tǒng)的建立及最佳外源基因表達位置的確定.pdf

1、新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)感染所引起的一種急性并有高度接觸性的禽類傳染病。ND自從被發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)多次在世界范圍內(nèi)大型爆發(fā)過，對世界范圍內(nèi)的養(yǎng)禽業(yè)構(gòu)成了十分嚴重威脅，目前是世界上最嚴重的禽類傳染病之一。城疫病毒NDV按照致病型的不同一般分為三類，即速發(fā)型、中發(fā)型和緩發(fā)型。這其中，速發(fā)型NDV又可分為嗜內(nèi)臟型和嗜肺腦型。消化道出血性病變是速發(fā)性

2、嗜內(nèi)臟型NDV的主要特征，其致死率高達90％以上。自從NDV的反向遺傳系統(tǒng)被建立以來，已經(jīng)成功拯救多個NDV毒株。眾所周知，在表達載體相同的情況下，疫苗的免疫效果通常與所插入的具有免疫原性的外源基因的表達量息息相關(guān)。即外源基因表達量越高，免疫效果通常越好。但是，一般情況下，外源基因插入載體的位置不同，其表達量也會不同。NDV病毒載體傳統(tǒng)的外源基因攜帶方式是將目的基因插入到兩個病毒基因組基因之間，形成一個獨立的基因框架，增加了病毒基因的數(shù)

3、量。影響病毒的生長和復(fù)制。
　　為了進一步確定外源基因的最佳表達位置，先后將內(nèi)部核糖體進入位點-紅色熒光蛋白IRES-RFP插入到NDV rLaSota載體的NP基因內(nèi)部、P基因內(nèi)部、M基因內(nèi)部、F基因內(nèi)部、HN基因內(nèi)部以及L基因內(nèi)部，成功的構(gòu)建并拯救了一系列的外源基因(IRES-RFP)插入位置不同的重組NDV。通過分析TCID50、EID50、MDT、ICPI等多項生物學(xué)特性指標得出，拯救病毒rLS-NP-IRES-RFP，r

4、LS-P-IRES-RFP，rLS-M-IRES-RFP，rLS-F-IRES-RFP，rLS-HN-IRES-RFP和rLS-L-IRES-RFP很好的保持了其親本病毒rLaSota弱毒株的生物學(xué)特性，并未發(fā)現(xiàn)任何毒力增強的現(xiàn)象。同時，病毒的生長曲線結(jié)果顯示，所有拯救病毒均表現(xiàn)出了與rLaSota病毒相似的復(fù)制特性及生長動力學(xué)特性。說明用IRES攜帶外源基因，插入在NDV基因組基因的尾部這一新的外源基因的攜帶方法對病毒的復(fù)制和生長幾乎

5、沒有任何影響，很好的解決了傳統(tǒng)方法將外源基因插入到基因組基因之間所帶來的影響病毒生長復(fù)制的弊端。之后，又采用多功能酶標儀和Real-time PCR等檢測手段，在蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平分別對重組病毒RFP基因的表達進行了鑒定，實驗結(jié)果不僅首次系統(tǒng)直接的證實了新城疫病毒mRNA轉(zhuǎn)錄量是按照基因組3'至5'的順序逐次遞減的理論，更為重要的是，根據(jù)實驗結(jié)果，與其他外源基因插入位點相比較，當IRES-RFP位于NDV rLaSota載體NP基因內(nèi)部