重組新城疫病毒NDV-rAnh-EGFP的構(gòu)建及其抑制腫瘤效果的研究.pdf

1、癌癥是人類死亡的主要病因。在臨床癌癥治療中,傳統(tǒng)的化療和放療治療療效有限,并具有強(qiáng)烈的毒副作用.促使科研學(xué)者尋找新的腫瘤治療手段。應(yīng)用溶瘤病毒治療腫瘤是近年來發(fā)展非常迅速的一種腫瘤治療策略。新城疫病毒(NDV)為單股負(fù)鏈RNA病毒,隸屬副粘病毒科禽副粘病毒屬。NDV能夠選擇性在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,而對(duì)人正常細(xì)胞無明顯影響。因此,目前新城疫病毒作為溶瘤病毒正在被廣泛地應(yīng)用于腫瘤治療。而反向遺傳學(xué)操作技術(shù)的應(yīng)用使得通過對(duì)病毒基因組的改造進(jìn)一步增

2、加病毒的療效及安全性成為可能。
　　 新城疫病毒Anhinga株最早是在美國佛羅里達(dá)州動(dòng)物園圈養(yǎng)的鳥類中發(fā)現(xiàn)的,屬于中等毒力株。目前,尚未有Anhinga株應(yīng)用于腫瘤治療的研究報(bào)告。本研究主要探討利用反向遺傳操作技術(shù)構(gòu)建的重組新城疫病毒Anhinga株在癌癥治療中的有效性。首先在HN基因和L基因之間插入了增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的開放閱讀框,并同時(shí)添加了相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列GE和GS,最終構(gòu)成了帶有EGFP基因的NDV全長cDNA。

3、攜帶全長cDNA的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒與分別表達(dá)核衣殼蛋白、磷酸化蛋白、大聚合酶蛋白的輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染能夠穩(wěn)定表達(dá),T7RNA聚合酶的BSRT7/5細(xì)胞。拯救得到表達(dá)增強(qiáng)型綠熒光蛋白的重組新城疫病毒NDV-rAnh/EGFP首先通過雞胚進(jìn)行增殖并收獲尿囊液。通過觀察EGFP在NDV-rAnh/EGFP感染的活細(xì)胞中(BSRT7/5)的表達(dá)情況證實(shí)表達(dá)外源基因的重組新城疫病毒拯救成功。將NDV-rAnh/EGFP在雞胚中連續(xù)傳代15代,鑒定得知所插入

4、的重組新城疫病毒外源基因可以持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。在HepG-2細(xì)胞中進(jìn)行的重組病毒增殖實(shí)驗(yàn)表明,外源基因片段EGFP的插入并未對(duì)病毒的增殖造成影響。
　　 在體外實(shí)驗(yàn)中,利用MTT方法檢測不同病毒滴度NDV-rAnh/EGFP對(duì)幾種腫瘤細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果表明,NDV-rAnh/EGFP可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長。但是,對(duì)于不同腫瘤細(xì)胞,抑制效果大不相同。NDV-rAnh/EGFP對(duì)腫瘤的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性并且與病毒本身在不同

5、腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制能力有關(guān)。
　　 為了在體內(nèi)試驗(yàn)中檢測重組NDV-rAnh/EGFP對(duì)腫瘤的抑制作用,建立昆明小鼠H22腹水瘤模型和H22皮下實(shí)體瘤模型,分別通過腹腔注射和瘤內(nèi)注射NDV-rAnh/EGFP治療腫瘤,結(jié)果表明重組新城疫病毒可以有效延長H22腹水瘤模型小鼠的生存時(shí)間,抑制H22肝癌實(shí)體瘤生長。
　　 綜上所述,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用反向遺傳操作技術(shù),成功拯救重組新城疫病毒NDV-rAnh/EGFP株。在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)N