重組新城疫病毒rClone30-CD的構(gòu)建及其抑制腫瘤效果的研究.pdf

1、惡性腫瘤是威脅人類健康的重大疾病，盡管針對腫瘤治療的手段已有較大的改善和提高，但仍不能明顯提高對腫瘤的抑制效率和增加患者的生存幾率。傳統(tǒng)的治療手段有放射療法和化學(xué)療法，但二者的治療存在很大風(fēng)險(xiǎn)，治療過程還會給患者帶來痛苦且存在副作用。手術(shù)切除腫瘤法，雖然可以去除病灶，但依然有腫瘤擴(kuò)散和復(fù)發(fā)的可能性。新城疫病毒(Newcastledisease virus，NDV)為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，隸屬于副粘病毒科禽副粘病毒屬。上世紀(jì)六十年

2、代，研究發(fā)現(xiàn)NDV可用于治療人類腫瘤，其可在腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行特異性復(fù)制，同時(shí)對正常細(xì)胞并無明顯的影響。反向遺傳操作技術(shù)已經(jīng)成熟建立，目前應(yīng)用十分廣泛。研究者可以利用該技術(shù)對病毒基因組加以改造，使野生型毒株的抗腫瘤效果得以提升。本研究將自殺基因CD插入到重組新城疫病毒的基因組中，并通過反向遺傳操作技術(shù)拯救病毒，協(xié)同5氟胞嘧啶(5-flucytosine，5-FC)，增加治療的靶向性，達(dá)到抑制腫瘤的目的。
　　 CD(Cytosine

3、 deaminase)為自殺基因家族的成員之一，它存在于大腸桿菌或酵母菌等基因組當(dāng)中，在哺乳動物體內(nèi)并不存在。CD可將相應(yīng)的無毒前導(dǎo)藥物(prodrug)5-FC轉(zhuǎn)化為具有毒性的抗腫瘤藥物5氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)，后者可引起腫瘤細(xì)胞死亡。通過克隆技術(shù)獲得大腸桿菌E.coli JM109菌株全基因組中的CD基因，構(gòu)建成真核表達(dá)質(zhì)粒pEE12.4-CD-IRES-EGFP(pEE12.4IE-CD)并轉(zhuǎn)染HepG

4、2細(xì)胞，為驗(yàn)證CD表達(dá)產(chǎn)物的體外生物學(xué)活性，以不同濃度的5-FC孵育單層細(xì)胞，采用MTT法檢測細(xì)胞的死亡率，結(jié)果表明CD轉(zhuǎn)化5-FC效果良好，HepG2細(xì)胞生長受到顯著抑制。
　　 攜帶自殺基因進(jìn)入細(xì)胞的常用載體有慢病毒和腺病毒，這兩種載本身并不具備殺傷腫瘤的作用。而利用自身具有抗腫瘤能力的新城疫病毒作為載體，攜帶CD基因進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，可以增強(qiáng)二者的抗腫瘤能力。本研究首次利用反向遺傳操作技術(shù)在重組新城疫病毒弱毒株LaSota r

5、Clone30基因組的F基因和HN基因之間插入了CD基因的開放閱讀框，構(gòu)建帶有CD基因的NDV全長cDNA轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pBrClone30-CD。將該轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒與表達(dá)核衣殼蛋白、磷酸化蛋白以及大聚合酶蛋白的輔助質(zhì)粒，共同轉(zhuǎn)染能夠穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的BHK-21細(xì)胞，拯救后獲得的重組新城疫病毒于SPF雞胚中進(jìn)行增殖，并收集尿囊液進(jìn)行血凝和血凝抑制實(shí)驗(yàn)，重組病毒命名為重組新城疫病毒rClone30-CD株。通過在雞胚中連續(xù)傳代8代，確定插

6、入CD基因的新城疫病毒可以穩(wěn)定增殖。說明CD基因片段的插入并未對病毒復(fù)制能力造成影響。
　　 在體外實(shí)驗(yàn)中，采用MTT法檢測不同MOI的重組新城疫病毒對HepG2細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果表明，重組病毒可以有效地抑制HepG2細(xì)胞的生長，并呈現(xiàn)劑量依賴性。在較高的MOI條件下，rClone30-CD/5-FC抑制效果明顯大于rClone30-CD，說明重組新城疫病毒與前導(dǎo)藥物5-FC協(xié)同效果顯著。
　　 在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，我們首先

7、對5-FC的半數(shù)致死量(LD50)和最大安全劑量進(jìn)行測定，保證實(shí)驗(yàn)小鼠的安全和藥物注射劑量的最優(yōu)化。建立昆明小鼠H22腹股溝皮下荷瘤模型，通過瘤內(nèi)注射重組新城疫病毒，并采用瘤內(nèi)或尾靜脈兩種不同的方式注射5-FC，達(dá)到協(xié)同治療腫瘤的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與rClone30-CD治療組相比，rClone30-CD/5-FC抑制腫瘤生長的效果明顯，重組新城疫病毒與前導(dǎo)藥物5-FC協(xié)同效果顯著，而且可以提高小鼠的存活率。兩種不同給藥方法所得到結(jié)果

8、一致，說明瘤內(nèi)注射或尾靜脈注射5-FC，均能達(dá)到良好的抑制腫瘤目的。對小鼠血樣中5-FU的含量進(jìn)行測定，在rClone30-CD/5-FC組的樣本中檢測到5-FU的存在，5-FC組未檢出5-FU。結(jié)果表明，插入到NDV中的外源CD基因具有生物學(xué)活性，可將5-FC轉(zhuǎn)化為5-FU，并且由于5-FU的存在，使得rClone30-CD/5-FC的抗腫瘤作用顯著提升。
　　 綜上所述，本研究應(yīng)用反向遺傳操作技術(shù)，成功拯救重組NDV rCl