季銨鹽類藥物對MthK鉀離子通道的作用機制研究.pdf

1、研究目的
　　通過研究季銨鹽類藥物對MthK鉀離子通道的作用機制,闡明抑制劑對鉀通道胞內(nèi)側(cè)的抑制方式和作用位點。MthK通道是一種來源于古生甲烷桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)的鈣激活配體門控的鉀離子通道。雖然MthK的高分辨的晶體結(jié)構(gòu)(1.45?)已被視為鉀離子通道的研究的結(jié)構(gòu)模型,但MthK通道的藥理學(xué)研究進展緩慢。揭示藥物對MthK離子通道的作用機制,不僅對生命科學(xué)基礎(chǔ)研究有很

2、重要的推進作用,也對哺乳動物鉀離子通道抑制劑的研究以及對臨床研究藥物機理的研究有一定的指導(dǎo)作用。季銨鹽類藥物(QAs)是一類經(jīng)典的鉀離子通道阻斷劑,QAs可以抑制hERG通道、TREK-1、TASK、Shaker鉀通道等[1,2,3],其中TEA于2011年被美國FDA批準為治療重癥肌無力的藥物。但是季銨鹽類藥物作用鉀離子通道的藥理機制和結(jié)合靶點仍然缺乏三維結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),在單通道機制方面的研究也不多[4-6]。因此本課題旨在通過三維結(jié)構(gòu)分析

3、和單通道電生理技術(shù),闡明季銨鹽類藥物(QAs)對MthK鉀離子通道的作用機理,填補這一領(lǐng)域的一些空白。探討對MthK通道電流的抑制作用機制,對理解很多鉀離子通道的抑制作用都有借鑒和指導(dǎo)作用。
　　研究方法
　　1、蛋白表達和純化。采用基因工程技術(shù)對克隆的MthK基因進行定點突變,運用原核表達系統(tǒng)表達野生型 MthK蛋白,使用 FPLC純化技術(shù)分離純化野生型和突變體蛋白。
　　2、合成不同分子側(cè)鏈的季銨鹽類藥物。利用化學(xué)

4、合成的方法,合成碳側(cè)鏈疏水性遞增的五種季銨鹽類的四乙基銨(TEA)、四丙基銨(TPrA)、四丁基銨(TBA)、四戊基銨(TPeA)等季銨鹽類藥物。
　　3、平面脂質(zhì)雙分子層實驗。運用電生理平面脂質(zhì)雙分子層技術(shù)記錄季銨鹽類藥物對MthK通道電流的影響。分析藥物對 MthK鉀離子通道的作用機制。我們還針對E96位點的功能以及藥理學(xué)意義進行了研究。
　　實驗結(jié)果
　　1、季銨鹽類藥物對MthK鉀離子通道都有明顯的抑制作用。<

5、br>　　季銨鹽側(cè)鏈的疏水性與對 MthK鉀離子通道的抑制作用強弱呈正相關(guān),隨著分子體積和側(cè)鏈延長,QA的抑制作用增強;而大于五個碳側(cè)鏈或親水基團側(cè)鏈的季銨鹽類藥物對 MthK的抑制強度則減弱。這說明:一、季銨鹽類藥物主要通過疏水作用抑制 MthK通道。二、藥物分子大小與作用位點的空間位阻影響其抑制作用。也即,藥物分子偏離最適大小會降低抑制效果。
　　2、季銨鹽類藥物通過兩種作用方式抑制MthK通道。
　　小分子側(cè)鏈的季銨鹽

6、主要抑制 MthK的電流幅度,不影響開放頻率,而大分子側(cè)鏈的季銨鹽則降低其開放頻率,不影響電流幅度。介于兩者之間的季銨鹽既抑制通道的電流幅度同時也抑制通道的開放頻率。這提示存在兩種作用方式:小分子側(cè)鏈的季銨鹽由于帶較強的正電性,可能主要通過靜電力作用于通道,它能快速的結(jié)合又能快速的解離,因此表現(xiàn)為電流幅度減小;而大分子側(cè)鏈的季銨鹽疏水性較強,可與孔道內(nèi)部的疏水基團結(jié)合,通過空間位阻作用而阻塞通道。
　　3、E96位點是MthK通道

7、電流抑制劑作用的一個重要作用位點。
　　突變體E96Q是將MthK通道上帶負電荷的96位谷氨酸突變?yōu)橹行噪姾傻墓劝滨０?通過電生理測試發(fā)現(xiàn):TEA主要抑制突變體E96Q通道的電流頻率而不抑制通道的電流幅度,與TEA對野生型MthK的作用效果完全不同。說明E96位點可通過陰離子的靜電作用與TEA相互作用,使TEA在胞內(nèi)側(cè)的孔道口實現(xiàn)快速的阻塞通道,又可快速的解離恢復(fù)通道活性。鈣離子對突變體E96Q通道電流幅度抑制作用減弱,說明該位點