膜磷脂對hEAG1鉀離子通道的調(diào)控研究.pdf

1、離子通道介導(dǎo)特定類型的離子有效跨膜流動(dòng)，是細(xì)胞電活動(dòng)產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)，同時(shí)在機(jī)體的正常生理活動(dòng)和病理過程中發(fā)揮重要作用。離子通道的功能異常會(huì)導(dǎo)致多種人類疾病，比如心律失調(diào)、以及癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)性疾病等。而越來越多的證據(jù)表明，離子通道的異常表達(dá)跟癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。比如，一些離子通道的調(diào)節(jié)劑已被證明具有抗腫瘤活性。鑒于離子通道在膜表面的定位以及一定結(jié)構(gòu)和組織分布的特異性，使得離子通道成為治療多種相關(guān)疾病的潛在靶點(diǎn)。實(shí)際上，大約13%的藥物

2、都是通過靶向離子通道來行使其治療功能。在眾多離子通道中，鉀離子通道是種類最多的一種，鑒于它們的結(jié)構(gòu)以及在多種疾病中扮演的角色，它們具有被開發(fā)成新的治療靶點(diǎn)的潛力。作為電壓門控K+通道的一個(gè)重要成員，人的etheràgo-go(hEAG1，Kv10.1，KCNH1)K+通道跟人體發(fā)育障礙以及70%以上腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是潛在的腫瘤診斷標(biāo)志物以及癌癥和神經(jīng)障礙性疾病的治療靶標(biāo)。盡管如此，由于缺乏內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑，我們對 hEAG1的生理調(diào)

3、控功能知之甚少。因此，尋找一種新的hEAG1內(nèi)源性調(diào)控劑對深入研究該通道的生理特性和功能以及設(shè)計(jì)以hEAG1作為治療靶點(diǎn)的藥物就顯得十分必要。
　　磷脂是細(xì)胞膜上的重要組成成分，它們功能性調(diào)控膜蛋白是細(xì)胞行使自身功能和新陳代謝的必不可少的部分。PIP2作為膜內(nèi)側(cè)最為豐富的一類磷脂，除了作為第二信使IP3和DAG的前體，其自身也被證明是多種離子通道行使功能的輔因子，如Kv、Kir、KCNQ和Cav等通道。通過與這些通道直接或間接的相

4、互作用，PIP2在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演重要角色。鑒于PIP2對離子通道具有如此重要的調(diào)控功能，且未見其對 hEAG的研究報(bào)道，促使我們想了解PIP2是否也能夠調(diào)控hEAG1通道。
　　在CHO細(xì)胞中通過內(nèi)面向外的膜片鉗技術(shù)，以及在HKE293T細(xì)胞中通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)的結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，外源性的PIP2強(qiáng)烈地抑制hEAG1的K+電流。而通過雷帕霉素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和5-羥色胺誘導(dǎo)的磷脂酶C活性信號(hào)通路來水解細(xì)胞膜上的PIP2也會(huì)增強(qiáng)hE

5、AG1在生理膜電位下的活性，表明PIP2能夠?qū)EAG1產(chǎn)生內(nèi)源性的抑制。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，這種抑制作用不光具有濃度依賴性，而且對不同的磷脂具有選擇性，這種選擇性要求磷脂具有長鏈?zhǔn)杷布岸鄠€(gè)負(fù)電荷的磷酸頭。為了驗(yàn)證PIP2是否直接地與hEAG1相互作用，我們使用一種新近發(fā)明的用于研究生物大分子和小分子結(jié)合的生物膜干涉技術(shù)（BLI）來檢測PIP2與hEAG1通道蛋白的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。通過該項(xiàng)技術(shù)，我們觀察了生理濃度下的PIP2與純化的hEAG

6、1通道蛋白的動(dòng)態(tài)結(jié)合，結(jié)果顯示BLI測定所得的KD值和膜片鉗記錄得到的IC50結(jié)果具有很高的一致性，表明PIP2對hEAG1的直接調(diào)控作用。而進(jìn)一步結(jié)合分子突變、電生理和BLI技術(shù)發(fā)現(xiàn)，PIP2通過結(jié)合到hEAG1的N末端的一段由12個(gè)氨基酸組成的區(qū)域來抑制該通道的活性。該P(yáng)IP2結(jié)合區(qū)域也是Ca2+/CaM跟hEAG1的結(jié)合區(qū)域，盡管這兩個(gè)結(jié)合區(qū)域重疊，但電生理實(shí)驗(yàn)表明它們之間并不會(huì)相互干擾彼此對hEAG1的結(jié)合和調(diào)控。PIP2同時(shí)展

7、現(xiàn)對hEAG2的抑制作用，hEAG1和hEAG2在PIP2結(jié)合區(qū)域的保守性表明N末端對PIP2調(diào)控這兩個(gè)通道至關(guān)重要。結(jié)合EAG通道的門控機(jī)制，我們推測PIP2可能通過結(jié)合在N末端區(qū)域來改變eag-CNBHD復(fù)合體的空間構(gòu)象進(jìn)而影響通道的門控行為。
　　基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們得出以下結(jié)論：
　　（1）外源性的和內(nèi)源性的PIP2都能夠抑制hEAG1的活性；
　　（2）BLI實(shí)驗(yàn)顯示PIP2能夠與hEAG1直接相互作用；<

8、br>　?。?）PIP2結(jié)合hEAG1的位點(diǎn)位于該通道的N末端一段區(qū)域；
　?。?）盡管PIP2與鈣調(diào)蛋白（CaM）在hEAG1的結(jié)合位點(diǎn)重疊，但它們在功能上并不相互影響。
　　總之，我們的實(shí)驗(yàn)證明了PIP2是hEAG1新的內(nèi)源性調(diào)控劑，這也提示通過操控PIP2的信號(hào)通路可能會(huì)為治療hEAG1相關(guān)的離子通道病提供一個(gè)策略。
　　本論文的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)：
　?。?）首次證明了PIP2能夠調(diào)控hEAG1，并確立了PIP2