ChIP-chip技術(shù)篩選胃癌相關(guān)抑制基因及其表遺傳學(xué)調(diào)控機制的研究.pdf

1、前言：
　　胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一。在世界范圍內(nèi)，在男性中其死亡率居癌癥死因的第二位，而在女性中其死亡率居癌癥死因第三位。我國胃癌發(fā)病率居各類腫瘤的首位，約42％的胃癌病人出現(xiàn)在我國。大部分病人診斷時已處于進展期，預(yù)后不良。因此，需要對胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子學(xué)機制進行進一步的研究。
　　近年來，越來越多的證據(jù)證實表遺傳學(xué)的改變在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用。這些表遺傳學(xué)包括組蛋白修飾、DNA甲基化是不依賴基因

2、的突變和缺失而導(dǎo)致基因失活的重要機制。胃癌相關(guān)抑制基因的失活往往伴隨著異常的組蛋白修飾、DNA甲基化。其中，組蛋白修飾被稱為“組蛋白密碼”可以影響染色體的結(jié)構(gòu)和基因的轉(zhuǎn)錄，在腫瘤的形成中起到很關(guān)鍵的作用。組蛋白賴氨酸的甲基化和乙?；莾煞N研究最為透徹的組蛋白修飾方式，被認為參與多種分子生物過程的調(diào)控，如基因的激活和失活，X-染色體的活化，DNA的修復(fù)以及細胞周期的調(diào)控等。其中，高水平的H3K9乙酰化和H3K4三甲基化被認為可以激活基因轉(zhuǎn)

3、錄，而高水平的H3K9三甲基被認為與基因的失活相關(guān)。
　　在后基因時代，高通量技術(shù)的出現(xiàn)使在基因組水平上對腫瘤細胞進行分析成為可能。染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)合芯片(ChIP-chip)已經(jīng)被廣泛用于基因組水平腫瘤的研究。在本項研究中，我們利用ChIP-chip技術(shù)篩選胃癌中的抑制基因并對其表遺傳學(xué)調(diào)控機制及抑癌基因功能進行了深入的研究。
　　目的：
　　本研究旨在利用ChIP-chip技術(shù)篩選胃癌相關(guān)抑制基因，闡明其表遺傳學(xué)改

4、變情況，并且利用表遺傳學(xué)調(diào)控相關(guān)藥物進行干預(yù)，探討其表遺傳學(xué)調(diào)控的機制。(1)采用Roche-NimbleGen的Human3×720K RefSeq Promoter Array篩選H3K9Me3 ratio值/H3K9Ac ratio值＞2的基因及H3K9Me3 ratio值/H3K4Me3 ratio值＞2的基因。并選取4個候選基因利用ChIP-qPCR實驗驗證ChIP-chip結(jié)果。(2)分析3個候選基因在胃癌細胞中的mRNA表

5、達及啟動子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)。進一步通過體外實驗研究胃癌細胞株在表遺傳學(xué)調(diào)控相關(guān)藥物的干預(yù)下3個候選基因的表達是否可以逆轉(zhuǎn)，由此探討表遺傳學(xué)調(diào)控相關(guān)藥物在治療胃癌的臨床應(yīng)用價值。(3)通過體外構(gòu)建3個候選基因之一的PSD基因表達降低的胃癌細胞株，觀察對其增殖和侵襲能力的影響，進一步論證其抑癌基因功能及作用機制。
　　方法：
　　一、實驗對象
　　2009年4月～2010年6月中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所行根治性手術(shù)治療的胃癌

6、患者癌和癌旁配對組織共40例;人胃癌細胞株SGC7901、MKN45、 BGC823、AGS和永生化正常人胃細胞株GES1。
　　二、實驗方法
　　1、細胞培養(yǎng):GES1、SGC7901、MKN45、BGC823和AGS按常規(guī)培養(yǎng)。DNA甲基化酶抑制劑(5-Aza-2-deoxycytidine)和/或組蛋白去乙?；敢种?TrichostatinA)對胃癌細胞株進行藥物干預(yù)及siRNA。
　　2、ChIP-chip技

7、術(shù)篩選胃癌相關(guān)抑制基因。
　　3、ChIP-qPCR實驗驗證芯片篩選基因結(jié)果的可靠性。
　　4、MSP法檢測相關(guān)抑制基因啟動子DNA甲基化狀況。
　　5、qRT-PCR檢測相關(guān)抑制基因mRNA在細胞和組織水平的表達。
　　6、CCK-8法檢測藥物干預(yù)及siRNA前后胃癌細胞增值力的變化。
　　7、細胞劃痕實驗及Transwell侵襲實驗檢測藥物干預(yù)及siRNA前后胃癌細胞遷移及侵襲能力的變化。
　　8

8、、Western blot檢測胃癌旁和癌組織中PSD蛋白表達含量。
　　結(jié)果：
　　第一部分應(yīng)用ChIP-chip技術(shù)篩選胃癌相關(guān)抑制基因的研究
　　ChIP-chip結(jié)果顯示134個基因的H3K9Me3 ratio值/H3K9Ac ratio值＞2以及46個基因的H3K9Me3 ratio值/H3K4Me3 ratio值＞2。4個篩選基因進行ChIP-qPCR檢測，結(jié)果與芯片分析結(jié)果相一致。
　　第二部分胃癌細

9、胞中篩選基因PSD、SMARCC1及Vps37A的表達及其表遺傳學(xué)調(diào)控機制
　　1、qRT-PCR結(jié)果顯示，在胃癌細胞中的篩選基因PSD、SMARCC1表達水平均低于胃正常粘膜上皮細胞。然而，篩選基因Vps37A表達水平在胃癌細胞與胃正常粘膜上皮細胞之間沒有顯著差異。
　　2、MSP結(jié)果顯示，在胃癌細胞中的PSD基因DNA啟動子區(qū)表現(xiàn)為甲基化，SMARCC1基因表現(xiàn)為部分甲基化。然而，Vps37A基因表達為非甲基化。

10、　　3、表遺傳學(xué)調(diào)控相關(guān)藥物（5-Aza-2-deoxycytidine、Trichostatin A）對胃癌細胞MKN45細胞的增殖、遷徙及侵襲能力有明顯影響。并且可以逆轉(zhuǎn)PSD、SMARCC1基因DNA啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)，從而恢復(fù)PSD、SMARCC1基因mRNA的表達。但對Vps37A基因mRNA的的表達無明顯影響。
　　第三部分 PSD基因抑癌作用機制的探討以及其臨床意義
　　1、胃癌細胞中PSD基因表達水平明顯低

11、于GES1細胞，DNA甲基化及異常組蛋白修飾共同調(diào)控PSD基因表達。
　　2、篩選PSD相對高表達的胃癌細胞株SGC7901采用siRNA技術(shù)下調(diào)其表達后，胃癌細胞株SGC7901的增殖力、侵襲力均明顯增強。
　　3、下調(diào)PSD基因表達后，胃癌細胞SGC7901的細胞增殖、遷徙及侵襲能力明顯提高。
　　4、檢測篩選基因調(diào)控的細胞因子（Caspase3、Caspase7）的蛋白表達水平在轉(zhuǎn)染后明顯下調(diào)。
　　5、胃

12、癌組織中PSD基因mRNA及蛋白表達水平明顯低于癌旁組織，并與腫瘤分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)與其他臨床病理學(xué)特征具有相關(guān)性。
　　結(jié)論：
　　1、啟動子芯片結(jié)合芯片技術(shù)(ChIP-chip)可以高通量的篩選胃癌中受表遺傳學(xué)機制調(diào)控的抑癌基因。
　　2、在胃癌細胞中，抑癌基因PSD、SMARCC1的表達下調(diào)是組蛋白修飾和DNA甲基化共同作用的結(jié)果。
　　3、PSD基因在胃癌中起到抑癌基因功能，其作用機制可能與誘