NSPc1沉默HOX基因的表觀遺傳學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、Polycomb家族蛋白(Polycombgroupproteins，PcGs)在進(jìn)化中高度保守，存在于幾乎所有細(xì)胞中，在胚胎發(fā)育、胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞狀態(tài)的維持、細(xì)胞命運(yùn)決定以及腫瘤形成等過程中起非常重要的作用。NSPcl(NervousSystemPolycomb1，又名PCGF1，Polycombgroupringfinger1)是于2001年分離、鑒定的PcG家族的一個(gè)新基因，與哺乳動(dòng)物PcG家族成員MEL18，BMI1具有較

2、高同源性。然而，無論在功能還是在作用機(jī)制方面，NSPcl都相對(duì)缺乏研究。曾有報(bào)告指出，NSPcl在多種腫瘤中高表達(dá)；我們前期的工作結(jié)果表明，過表達(dá)NSPcl能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖；相反，NSPcl敲低的腫瘤細(xì)胞則表現(xiàn)為生長緩慢、接觸抑制。本論文重點(diǎn)對(duì)NSPcl抑制靶基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)控細(xì)胞增殖的分子機(jī)制進(jìn)行了研究。 首先，我們嘗試純化NSPcl功能性復(fù)合體，同時(shí)已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道，通過串聯(lián)親和純化(TandernAffinityPurific

3、ation，TAP)的方法，研究者發(fā)現(xiàn)NSPcl和其它PcG家族成員RING1，RING2，RYBP處于同一復(fù)合體中。通過免疫共沉淀(Coimmunoprecipitation，CoIP)實(shí)驗(yàn)，我們驗(yàn)證了NSPcl和RING2的相互作用。這一復(fù)合體與此前報(bào)道的組蛋白H2A泛素化復(fù)合體(humanPolycombrepressivecomplex1-like，hPRClL)很相似：其中RING2具有泛素E3連接酶活性，BMI1等增強(qiáng)其活性

4、，從而促進(jìn)H2A泛素化。同樣地，在HeLa細(xì)胞敲低NSPcl之后，細(xì)胞內(nèi)泛素化H2A(uH2A)整體水平明顯下降；相反，過表達(dá)NSPcl能促進(jìn)H2A泛素化；并且體外重組NSPcl蛋白能顯著增強(qiáng)RING2的活性。因此，NSPcl有可能通過促進(jìn)組蛋白H2A泛素化而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。 PcG家族蛋白通常通過調(diào)控HOX基因的轉(zhuǎn)錄而影響體節(jié)發(fā)育，因此，我們?cè)贖eLa和NT2/D1(人胚胎腫瘤細(xì)胞)細(xì)胞中通過RT-PCR的方法篩選了NSPc

5、l可能抑制的HOX勰結(jié)果表明，在NSPcl敲低的細(xì)胞中，HOXA7和HOXB13表達(dá)上調(diào)較為明顯。為了驗(yàn)證NSPcl介導(dǎo)的H2A泛素化是否參與這兩個(gè)HOX基因的轉(zhuǎn)錄抑制，我們?cè)谒鼈兊纳嫌芜M(jìn)行了染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NSPcl復(fù)合體確實(shí)結(jié)合于它們的啟動(dòng)子區(qū)，并且當(dāng)NSPcl敲低之后，RING2在相應(yīng)區(qū)域的結(jié)合減少，組蛋白H2A泛素化水平顯著下降，基本驗(yàn)證了我

6、們的設(shè)想。 PcGs蛋白在細(xì)胞內(nèi)多以復(fù)合體的形式起作用，至少可以分為兩大類：起始復(fù)合體(PolycombRepressiveComplex2，PRC2)和維持復(fù)合體(PolycombRepressiveComplex1，PRC1)，其中PRC2成員EZH2能引起組蛋白H3K27三甲基化(H3K27trimethylation，me3H3K27)，這一修飾又能募集PRC1復(fù)合體進(jìn)一步維持靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制。近年來研究還發(fā)現(xiàn)，PcGs

7、的轉(zhuǎn)錄抑制效應(yīng)與DNA甲基化(DNAmethylation)緊密相關(guān)，而后者也是參與基因轉(zhuǎn)錄抑制的一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾形式，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferases，DNMTs)DNMT1負(fù)責(zé)維持DNA甲基化。通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)PRC2成員EZH2或DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1敲低、或5-aza-dC(一種DNMTs抑制劑)處理的HeLa細(xì)胞中，HOXA7的表達(dá)也去抑制，即EZH2和D

8、NA甲基化也參與了HOXA7基因的沉默。 接下來，我們致力于揭示PcGs介導(dǎo)的組蛋白修飾與DNA甲基化如何協(xié)調(diào)而參與HOX基因沉默。通過ChIP和基因組亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序(Bisulfitesequencing)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)：在HeLa細(xì)胞中當(dāng)PRC2成員EZH2敲低之后，將導(dǎo)致DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1和PRC1成員NSPcl在HOXA7和HOXB13基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合都明顯減少；而敲低NSPcl之后，EZH2的募集和me

9、3H3K27水平不受影響，但是DNMT1結(jié)合卻被顯著抑制，并且相應(yīng)的DNA甲基化的水平也明顯下降；敲低DNMT1或者用其抑制劑5-aza-dC處理細(xì)胞，EZH2結(jié)合沒有變化，但NSPcl結(jié)合減少。因此，在HOX基因沉默過程中，EZH2介導(dǎo)的me3H3K27募集NSPcl/RING2復(fù)合體，后者促進(jìn)相應(yīng)區(qū)域的H2A泛素化；同時(shí)，EZH2可以直接募集DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMTs，起始并維持相應(yīng)CpG島的DNA甲基化；而下游的H2A泛素化及DN

10、A甲基化這兩種表觀遺傳學(xué)修飾之間不是孤立的，而是相互依賴(interdependent)的，因?yàn)闊o論干擾NSPcl還是DNMT1都會(huì)影響到對(duì)方在靶基因調(diào)控區(qū)的結(jié)合和功能，使靶基因去抑制，即它們協(xié)同作用，維持HOX靶基因的穩(wěn)定、長期、不可逆的沉默。 本論文揭示了PcG家族蛋白NSPcl的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式，這一模式與近年來提出的腫瘤發(fā)生的表觀遺傳學(xué)機(jī)制相似，建立了NSPcl與其它表觀遺傳調(diào)節(jié)因子(如其它PcG蛋白和DNMTs)在細(xì)胞