食管鱗狀細(xì)胞癌中DACT1、2、3基因的表達(dá)及表觀遺傳學(xué)失活機(jī)制的研究.pdf

1、目的:食管癌是常見且致死性較高的癌癥之一。食管鱗狀細(xì)胞癌是食管癌的主要類型。吸煙、多紅肉飲食、較低社會經(jīng)濟(jì)狀態(tài)等都與食管鱗狀細(xì)胞癌的高發(fā)有關(guān)。近年來盡管在食管鱗狀細(xì)胞癌的治療方面有了一些進(jìn)步，但食管鱗狀細(xì)胞癌病人的整體生存率仍沒有明顯提高。
　　表觀遺傳學(xué)機(jī)制是基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的紐帶。DNA甲基化是目前研究最深入的一項(xiàng)表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制，其重要性主要體現(xiàn)在惡性腫瘤的早期診斷及判斷腫瘤患者預(yù)后。DAPPER家族包含三個(gè)基因:DA

2、CT1、DACT2和DACT3。人類DACT1、2、3基因分別由799、774、610個(gè)氨基酸殘基組成，并分別定位于人類染色體的14q22.3、6q27、19q13.32。序列檢索發(fā)現(xiàn)，DACT1、2、3基因啟動子區(qū)分別存在2個(gè)、1個(gè)、5個(gè)CpG島，由此推測DACT1、2、3基因可能也存在甲基化修飾的現(xiàn)象。本研究以四株食管癌細(xì)胞系和52例食管鱗狀細(xì)胞癌患者的癌組織及相應(yīng)癌旁組織作為標(biāo)本，分別檢測了DACT1、2、3基因在食管癌細(xì)胞系及腫

3、瘤組織中的甲基化狀態(tài)及其與mRNA表達(dá)的關(guān)系，進(jìn)一步探討DACT1、2、3基因在食管鱗狀細(xì)胞癌中的作用及其表達(dá)調(diào)控的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1、應(yīng)用RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)技術(shù)檢測食管癌細(xì)胞系和食管鱗癌及相應(yīng)癌旁正常粘膜組織中DACT1、2、3基因的mRNA表達(dá)情況。
　　2、應(yīng)用MSP(methylation specific

4、polymerase chain reaction)技術(shù)檢測食管癌細(xì)胞系及食管鱗癌和相應(yīng)癌旁正常粘膜組織中DACT1、2、3基因的甲基化發(fā)生情況。
　　3、應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)分析。
　　結(jié)果:
　　1、食管癌細(xì)胞系中DACT1、2、3基因的表達(dá)及甲基化狀態(tài)
　　1.15-aza-dC處理前后食管癌細(xì)胞系中DACT1、2、3的mRNA表達(dá)
　　5-aza-dC處理前，DACT1基因mR

5、NA在TE1、Eca109細(xì)胞株中表達(dá)較弱，在TE13、T.Tn細(xì)胞株中表達(dá)缺失;DACT2基因mRNA在TE13細(xì)胞株中表達(dá)較弱，在TE1、T.Tn、Eca109細(xì)胞株中表達(dá)缺失;DACT3基因mRNA在Eca109細(xì)胞株中表達(dá)較弱，在TE1、TE13、T.Tn細(xì)胞株中表達(dá)缺失。
　　5-aza-dC處理后，TE1、Eca109細(xì)胞株中DACT1基因表達(dá)升高，TE13、T.Tn兩細(xì)胞株中都檢測到DACT1mRNA的表達(dá);四種細(xì)胞

6、株中都檢測到DACT2、3mRNA的表達(dá)。
　　1.25-aza-dC處理前后食管癌細(xì)胞系中DACT1、2、3的甲基化狀態(tài)
　　5-aza-dC處理前，TE1、Eca109細(xì)胞中DACT1基因呈不完全甲基化，TE13、T.Tn細(xì)胞株中DACT1基因的啟動子區(qū)表現(xiàn)為高甲基化狀態(tài);TE13細(xì)胞株在DACT2中表現(xiàn)為不完全甲基化狀態(tài)，TE1、T.Tn、Eca109細(xì)胞株中DACT2呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài);DACT3在TE1、TE13、T

7、.Tn、Eca109細(xì)胞株中均呈非甲基化狀態(tài)。
　　5-aza-dC處理后，TE1細(xì)胞株中DACT1基因甲基化程度下降，非甲基化程度升高，TE13、T.Tn、Eca109細(xì)胞株中DACT1基因均呈非甲基化狀態(tài);DACT2、3基因在四種細(xì)胞株中均呈非甲基化狀態(tài)。
　　2、食管鱗癌組織中DACT1、2、3基因mRNA的表達(dá)
　　2.1食管鱗癌組織中DACT1基因mRNA的表達(dá)
　　在癌旁正常粘膜組織（0.91±0.7

8、7）中DACT1基因的mRNA表達(dá)量明顯高于食管鱗癌組織（0.60±0.48），兩者的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.413，P=0.019)。在食管鱗癌患者的標(biāo)本中，DACT1的mRNA表達(dá)量與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)(P＜0.05)，而與腫瘤分期、分化及患者年齡性別無關(guān)(P＞0.05)。
　　2.2食管鱗癌組織中DACT2基因mRNA的表達(dá)
　　在癌旁正常粘膜組織（0.95±0.64）中DACT2基因的mRNA表達(dá)量明顯高

9、于食管鱗癌組織（0.66±0.53），兩者的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.439，P=0.018)。在食管鱗癌患者的標(biāo)本中，DACT2的mRNA表達(dá)量與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)(P＜0.05)，而與腫瘤分期、分化及患者的年齡性別無關(guān)(P＞0.05)。
　　2.3食管鱗癌組織中DACT3基因mRNA的表達(dá)
　　在癌旁正常粘膜組織（1.02±0.52）中DACT3基因的mRNA表達(dá)量明顯高于食管鱗癌組織（0.67±0.49），兩

10、者的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.786，P=0.000)。DACT3的mRNA表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤組織分期、分化及患者年齡性別無關(guān)(P＞0.05)。
　　3、食管鱗癌組織中DACT1、2、3基因甲基化狀態(tài)
　　3.1食管鱗癌組織中DACT1基因甲基化狀態(tài)
　　DACT1基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率在癌旁正常粘膜組織和食管鱗癌組織中分別為15.4％(8/52)和48.1％(25/52)，癌旁正常粘膜組織中DACT1

11、甲基化發(fā)生率顯著低于食管鱗癌組織(P=0.000)。高中分化組中DACT1甲基化發(fā)生率為30.7％(8/26)，顯著低于低分化組發(fā)生率65.3％(17/26)（x2=6.240，P=0.012）;Ⅰ、Ⅱ期鱗癌組DACT1甲基化發(fā)生率為35.7％(15/42)，顯著低于Ⅲ、Ⅳ期甲基化發(fā)生率90.0％(9/10)(x2=9.578，P=0.002); DACT1基因甲基化發(fā)生率在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為20.0％(4/20)，顯著低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組

12、甲基化發(fā)生率62.5％(20/32)(x2=8.945，P=0.003)。在食管鱗癌組織中，DACT1基因的甲基化率與年齡、性別無關(guān)(P＞0.05)。
　　3.2食管鱗癌組織中DACT2基因甲基化狀態(tài)
　　DACT2基因在癌旁正常粘膜組織和食管鱗癌組織中的甲基化發(fā)生率分別為21.1％(11/52)和50.0％(26/52)，癌旁正常粘膜組織中DACT2基因甲基化率顯著低于食管鱗癌組織(P=0.002)。高分化和中分化鱗癌組D

13、ACT2基因甲基化發(fā)生率為34.6％(9/26)，顯著低于低分化組發(fā)生率65.3％(17/26)（x2=4.923，P=0.027）;Ⅰ、Ⅱ期鱗癌組DACT2基因甲基化發(fā)生率為40.4％(17/42)，顯著低于Ⅲ、Ⅳ期甲基化發(fā)生率90.0％(9/10)（x2=7.924，P=0.005）;沒有發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中DACT2基因甲基化發(fā)生率為25.0％(5/20)，顯著低于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的發(fā)生率65.6％(21/32)(x2=8.12

14、5，P=0.004)。在食管鱗癌組織中，DACT2基因甲基化發(fā)生率與年齡和性別無關(guān)（P＞0.05）。
　　3.3食管鱗癌組織中DACT3基因甲基化狀態(tài)
　　DACT3基因在癌旁正常粘膜組織和食管鱗癌組織中的甲基化發(fā)生率分別為7.7％(4/52)和11.5％(6/52)。癌旁正常粘膜組織中DACT3基因甲基化發(fā)生率與食管鱗癌組織相比，無顯著性差異(P=0.506)
　　4、DACT1、2、3基因甲基化與mRNA表達(dá)的相關(guān)

15、性
　　4.1 DACT1基因甲基化與mRNA表達(dá)的相關(guān)性
　　DACT1mRNA表達(dá)量在甲基化陰性和甲基化陽性的食管鱗癌組中分別為0.74±0.53和0.45±0.36，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-2.250，P=0.029)。
　　4.2 DACT2基因甲基化與mRNA表達(dá)之間的相關(guān)性
　　DACT2mRNA表達(dá)量在甲基化陰性和甲基化陽性的食管鱗癌組中分別為0.78±0.61和0.46±0.32，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

16、(t=-2.341，P=0.023)。
　　4.3 DACT3基因甲基化與mRNA表達(dá)之間的相關(guān)性
　　DACT3mRNA表達(dá)量在甲基化陰性和甲基化陽性的食管鱗癌組中分別為0.68±0.50和0.65±0.38，兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-0.120，P=0.905)。
　　結(jié)論:
　　1、在食管鱗癌組織中DACT1、2、3基因的mRNA表達(dá)量與相應(yīng)癌旁正常粘膜組織相比顯著降低，提示DACT1、2、3基因有抑癌傾向，

17、其表達(dá)下調(diào)可能是食管鱗癌發(fā)生的機(jī)制之一。
　　2、DACT1、2基因在食管鱗癌中的表達(dá)降低與基因的高甲基化狀態(tài)有關(guān)，提示DACT1、2基因甲基化可能是導(dǎo)致它們在食管鱗癌中表達(dá)降低的表觀遺傳學(xué)機(jī)制之一。
　　3、DACT1、2基因的甲基化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分期和分化有關(guān)，提示DACT1、2甲基化可能與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。
　　4、DACT3的表達(dá)降低與甲基化狀態(tài)無關(guān)，提示甲基化可能不是導(dǎo)致其表達(dá)降低的機(jī)制。