課件：表觀遺傳學(xué)

1、腫瘤的遺傳學(xué)與表觀遺傳學(xué)研究,腫瘤的發(fā)生是一個多基因多途徑的復(fù)雜多階段過程。 腫瘤的發(fā)生是遺傳和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，遺傳決定了個體的遺傳易感性，而環(huán)境因素決定了什么樣的易感個體患癌。,傳統(tǒng)的由多途徑多步驟的基因突變引起腫瘤的觀點(diǎn)日益受到挑戰(zhàn)。約翰霍普金斯大學(xué)的研究者認(rèn)為，腫瘤最早的發(fā)生可能源自干細(xì)胞階段的表遺傳學(xué)改變（epigenetic alterations）。,領(lǐng)導(dǎo)此項(xiàng)研究的Andrew Feinberg教授說，我們并非反

2、駁腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)生了基因改變的觀點(diǎn)，但我們認(rèn)為，表遺傳學(xué)上亦發(fā)生了改變而且來的更早些。Feinberg教授更提出了包含表遺傳學(xué)改變的腫瘤發(fā)生的三個過程，在傳統(tǒng)的二次打擊理論之前加上了表遺傳學(xué)改變這一重要步驟。許多尚未發(fā)現(xiàn)基因突變的細(xì)胞卻往往有了腫瘤細(xì)胞的特性，而現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)這些原代細(xì)胞經(jīng)常帶有表遺傳學(xué)的改變。,腫瘤發(fā)生中的遺傳因素,遺傳是指親代將一種性狀經(jīng)遺傳物質(zhì)傳遞給下一代的過程，是研究生物遺傳和變異的科學(xué)。變異指的是遺傳變異

3、；也就是一種性狀受遺傳影響而產(chǎn)生變異的可能值范圍。,現(xiàn)有的一些資料或證據(jù)不僅在細(xì)胞水平上而且在群體及家系水平上支持腫瘤的發(fā)生與遺傳有關(guān)。在人群中常可觀察到一些癌家族或某種癌有家族聚集特征，提示某種癌的顯性遺傳。許多遺傳性免疫缺陷的個體中腫瘤發(fā)生率明顯升高，可能與遺傳因子有關(guān)。,一些人類基因能繼發(fā)的導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，這些基因遺傳狀態(tài)使某些組織發(fā)生生長調(diào)控異常，然后這種組織再經(jīng)歷另一次突變而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。如：神經(jīng)纖維瘤、多發(fā)性結(jié)腸息肉癥、

4、甲狀腺髓樣癌等。有些罕見的隱性癌基因在純合狀態(tài)下導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定性（如發(fā)生斷裂等），致使宿主具有腫瘤發(fā)生易感性。,腫瘤的遺傳易感性,遺傳易感性實(shí)際上是個體遺傳變異對環(huán)境致癌因素的敏感程度。遺傳易感性是能夠代代遺傳下去的。由于各種易感基因的功能不同構(gòu)成了不同的遺傳因素，帶有不同遺傳因素的個體對環(huán)境因子的易感性有所不同。有遺傳易感性的個體比不具有遺傳易感性的個體，其腫瘤發(fā)病率高10-100倍。,決定腫瘤遺傳易感性的遺傳因素,1.代謝酶系統(tǒng)

5、： 體內(nèi)致癌物代謝基因多態(tài)性與腫瘤易感性有密切關(guān)系，如細(xì)胞色素P450酶、亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR)、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（SHMT)等。,2.染色體不穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)重排和癌基因的激活： 染色體的不穩(wěn)定性使染色體易發(fā)生自發(fā)或誘發(fā)的斷裂與裂隙，染色體的脆性部位是一種隨機(jī)發(fā)生斷裂的特殊點(diǎn)，預(yù)示著染色體的不穩(wěn)定性。在已定位的75個脆性位點(diǎn)中有16個是可遺傳的。脆性部位是腫瘤細(xì)胞染色體重排的易感部位，是致癌因子敏感的

6、位置，化學(xué)致癌原及輻射照射都在脆性位點(diǎn)處使染色體斷裂，染色體缺失和重排也往往發(fā)生在這些脆性部位。,3.免疫缺陷增加了腫瘤的發(fā)病率： 許多免疫缺陷疾患都有嚴(yán)重的或顯著的免疫抑制現(xiàn)象，從而增加了某些腫瘤的發(fā)病率。在這類免疫缺陷疾患中，遺傳因素通過影響致癌因子的代謝，免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，干擾素的分泌水平或?qū)Σ《靖腥镜姆磻?yīng)等諸方面去影響對癌癥的易感性。,4.單核苷酸多態(tài)與腫瘤易感性： 人類基因組計劃研究結(jié)果證明，不同個體的基

7、因99.9%都是一樣的，但在序列上有極小（0.1%）的遺傳差異，其中主要是單核苷酸多態(tài)（SNP)。SNP是指特定的核苷酸突變在人群中出現(xiàn)的頻率大于或等于1%，存在于整個基因組中，而小于1%稱為種系突變（germline mutation)，多發(fā)生于編碼區(qū)。,5.DNA修復(fù)缺陷和基因組不穩(wěn)定性： 環(huán)境因素是腫瘤發(fā)生的始動因素，而個人的遺傳特征決定腫瘤的易感性?；瘜W(xué)致癌物可以致使細(xì)胞基因發(fā)生突變，但正常的細(xì)胞具有DNA監(jiān)控修復(fù)系

8、統(tǒng)，保證細(xì)胞內(nèi)基因的正確修復(fù)和穩(wěn)定。一旦這些修復(fù)系統(tǒng)有遺傳缺陷，則無法修復(fù)而導(dǎo)致突變的存在，所以DNA修復(fù)能力缺陷或低下是化學(xué)致癌的重要機(jī)制之一。,6.癌基因種系突變和抑癌基因種系突變： 通常情況下癌基因和抑癌基因處于動態(tài)平衡，使細(xì)胞處于正常的發(fā)育生長和分化狀態(tài)中，一旦抑癌基因有遺傳缺失，癌基因活性異常，細(xì)胞過度生長則傾向腫瘤的發(fā)生。,腫瘤分子遺傳學(xué)新進(jìn)展,DNA水平的研究：1． 定位克隆癌基因和抑癌基因　　 利用各種

9、DNA多態(tài)性標(biāo)記對癌基因或抑癌基因進(jìn)行染色體定位進(jìn)而克隆該基因。2． 比較基因組雜交（comparative genomic hybridization,CGH） 　 比較基因組雜交是將熒光素分別標(biāo)記在去除了重復(fù)序列的腫瘤及正常細(xì)胞基因組DNA上，然后分別與正常染色體進(jìn)行原位雜交，對該兩種不同探針與各個染色體雜交后的信號進(jìn)行比較，以了解該腫瘤中細(xì)胞在不同染色體上缺失或擴(kuò)增的狀態(tài)。,3． 代表性差異分析（representiona

10、l difference analysis,RDA） 可用于檢測兩種不同DNA群中所存在的序列上的差異。,RNA水平的研究：1．消減雜交（subtractive hybridization）2．差異顯示PCR （differential display PCR,DD-PCR）3．cDNA代表性差異分析（ cDNA-RDA ）4．DNA芯片與探針微列陣,腫瘤發(fā)生中的表遺傳因素,在基因組中除了DNA和RNA序列以外，還有許多

11、調(diào)控基因的信息，它們雖然本身不改變基因的序列，但是可以通過基因修飾，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、DNA和其它分子的相互作用，而影響和調(diào)節(jié)基因的功能和特性，并且通過細(xì)胞分裂和增殖周期影響遺傳。表遺傳學(xué)1939年由Waddington首先提出，目前認(rèn)為表遺傳學(xué)是研究沒有DNA序列變化，可遺傳的基因表達(dá)(活性)的改變。,表遺傳學(xué)：是指非基因序列所致的可遺傳的變化,如DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑、RNA 干涉等,是在基因組層次上調(diào)控基因的表達(dá)

12、,即通過控制基因的表達(dá)時間、空間位置和表達(dá)方式來調(diào)控發(fā)育過程及各種生理反應(yīng)。是以基因表達(dá)水平改變?yōu)橹鞯难芯俊?盡管遺傳學(xué)和表遺傳學(xué)在許多方面存在著差異,但它們有著共同的理論基礎(chǔ),即多細(xì)胞生物體中每種細(xì)胞在遺傳學(xué)上是同質(zhì)的。遺傳學(xué)信息提供了包括表遺傳學(xué)修飾蛋白在內(nèi)的各種蛋白質(zhì)的藍(lán)圖,而表遺傳學(xué)信息調(diào)控一組基因何時、何地表達(dá)及其表達(dá)的程度。兩者密不可分并相互協(xié)調(diào), 兩者既有區(qū)別,彼此影響,又相輔相成,以共同確保細(xì)胞乃至生命有機(jī)體的正常功能。

13、,表遺傳突變與傳統(tǒng)的基因突變也有區(qū)別: 其一,表遺傳突變是可逆的;常發(fā)生在基因的啟動子區(qū),而基因突變則多發(fā)生在編碼區(qū); 其二,表遺傳突變及其回復(fù)突變的頻率高于基因突變及其回復(fù)突變的頻率。,腫瘤的表遺傳學(xué)研究進(jìn)展,1.DNA甲基化DNA甲基化是腫瘤中最常見的分子改變之一，包括基因組總體甲基化水平降低和某些基因啟動區(qū)域發(fā)生高甲基化(hypermethylation)。 腫瘤相關(guān)基因的異常甲基化在腫瘤的形成及發(fā)展上起著重要作用。

14、,低甲基化 在腫瘤中，低甲基化通常發(fā)生在中度和高度重復(fù)序列，包括異染色質(zhì)DNA重復(fù)序列、散布的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒元件.另外低甲基化也可發(fā)生于單一序列，如一些癌基因等。低甲基化可導(dǎo)致染色體的不穩(wěn)定。,高甲基化 癌細(xì)胞在整體低甲基化的水平下，一些局部特定區(qū)域是高甲基化，而這種特定區(qū)域一般是跨越管家基因和腫瘤抑制基因啟動子的CpG島區(qū)。現(xiàn)已確認(rèn)這種CpG島高甲基化作用在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用，也

15、是腫瘤發(fā)生中基因表達(dá)沉默的主要機(jī)制，尤其表現(xiàn)在腫瘤抑制基因和錯配修復(fù)基因。由于這種高甲基化具有誘導(dǎo)基因編碼區(qū)突變和使基因失活的能力而利于腫瘤的發(fā)展。,在一個癌細(xì)胞中，可有多種基因同時被異常甲基化。目前已鑒定的易高甲基化的基因包括：參與細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、耐藥性形成、分化、凋亡的基因及參與腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生成的基因。,從理論上講，一個腫瘤細(xì)胞中可有成百上千個CpG島被異常甲基化，但研究表明并不是這樣，每種腫瘤都有其自身一套基因是異常甲基化

16、。根據(jù)基因甲基化圖譜將腫瘤進(jìn)行分類和分型是有可能的。,根據(jù)Knudson 的二次打擊模型,腫瘤抑癌基因的雙等位基因都失活后,抑癌基因才被完全滅活,產(chǎn)生癌癥表型。研究顯示腫瘤可以在一個等位基因上穩(wěn)定地保持突變形式,而在另一個等位基因上則為高甲基化,由此導(dǎo)致該基因功能失活。,DNA 高甲基化有幾種可能機(jī)制: ①維持DNA 胞嘧啶甲基化的酶DNMT1 的失真; ②重建甲基化的酶DNMT3A 和DNMT3B 的異常; ③對異常甲基化DN

17、A的錯誤修復(fù)機(jī)制; ④染色質(zhì)重塑。,2.組蛋白修飾 核小體是染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位。核心組蛋白的N-端尾部暴露在核小體的表面并可發(fā)生共價修飾，從而對基因表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用。常見的組蛋白尾部修飾方式有：乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化、多聚ADP糖基化等，乙?；土姿峄强赡嫘孕揎棥Ｌ囟ǖ慕M蛋白修飾與特定的基因激活或抑制狀態(tài)相聯(lián)系，組蛋白修飾在基因調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。,3.基因組印記 基因組印記是一種在基因組DNA水

18、平對雙親等位基因特異性的修飾作用。該修飾作用是在胚胎發(fā)育早期形成的，它具有不包括DNA序列變化，但影響基因調(diào)控以及引起2個等位基因不同表達(dá)的特性。由于基因組印記在新生命誕生時已經(jīng)形成，所以很可能是癌前事件，由此很有可能成為癌癥早期診斷的指標(biāo)。目前相關(guān)研究較少。,近年來，針對腫瘤發(fā)生的遺傳學(xué)和表遺傳學(xué)改變，做了以下相關(guān)研究：1.腫瘤相關(guān)基因多態(tài)性對食管癌賁門癌發(fā)病風(fēng)險的影響；2.賁門癌抑癌基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)研究。,分別應(yīng)用序列特異

19、性引物PCR（SSP）及限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR－RFLP）等方法對免疫相關(guān)基因（TNF、IL-10、TGF-β1等）、細(xì)胞周期調(diào)控基因（ P21和P27）、DNA修復(fù)基因（XPA和XPC）等基因的單核苷酸多態(tài)性與食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）、賁門腺癌（GCA）發(fā)病風(fēng)險之間進(jìn)行了關(guān)聯(lián)研究，并得出了以下結(jié)論：,1.TNF-β+252G/A G/G和G/A基因型能顯著增加家族史陰性人群患食管癌和賁門癌的發(fā)病風(fēng)險。2. IL-10基因

20、G1082A多態(tài)性與ESCC和GCA的發(fā)病風(fēng)險無關(guān)。3. TGF-β1基因啟動子區(qū)C-509T位點(diǎn)T等位基因和T869C位點(diǎn)C等位基因可增加GCA的發(fā)病風(fēng)險。,4.p21 3′非翻譯區(qū)T/T基因型可顯著增加ESCC的發(fā)病風(fēng)險。5.XPA基因A23G位點(diǎn)的A/G+G/G基因型可顯著降低ESCC和GCA的發(fā)病風(fēng)險，在無上消化道腫瘤家族史的ESCC患者中這一趨勢更加明顯。,6. XPC第15外顯子C/C基因型可增加非吸煙個體ESCC的發(fā)病

21、風(fēng)險。第8外顯子C/T基因型可顯著降低GCA的發(fā)病風(fēng)險，在吸煙個體和家族史陰性個體中作用更加明顯。攜帶A/C、C/C單體型可顯著增加GCA的發(fā)病風(fēng)險。,分別應(yīng)用甲基化特異性PCR方法檢測了E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、 RAS 相關(guān)區(qū)域家族1A （RASSF1A）、螺旋酶樣轉(zhuǎn)錄因子 （HLTF）、 凝血酶敏感蛋白1（TSP1）等基因在賁門腺癌中的甲基化狀態(tài)，并對其甲基化狀態(tài)與轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的關(guān)系進(jìn)行了研究，并得出了以下結(jié)論：,E

22、-cadherin在賁門腺癌組織中的甲基化率為68.5%，顯著高于癌旁組織，并與其蛋白表達(dá)有明顯的相關(guān)性。RASSF1A在在賁門腺癌組織中的甲基化率為58.7%，顯著高于癌旁組織，且其高甲基化與 cyclin D1蛋白表達(dá)之間有明顯的相關(guān)性。,3. HLTF基因在賁門腺癌組織中的甲基化率為 45.8%，顯著高于癌旁組織。 4. TSP1在賁門腺癌組織中的甲基化率為35.4%，顯著高于癌旁組織，并與其蛋白表達(dá)有明顯的相關(guān)性, 且其在賁