新胃癌抑制基因HoxD10的分子調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展涉及癌基因活化和抑癌基因失活。DNA啟動子高甲基化被認(rèn)為是抑癌基因失活的最重要機(jī)制之一。尋找和驗證新的抑癌基因?qū)沂疚赴┬碌姆肿影l(fā)病機(jī)制，確定生物學(xué)靶標(biāo)干預(yù)癌變有重要意義。
　　 HoxD10屬Hox基因家族的一員，其表達(dá)產(chǎn)物是重要的轉(zhuǎn)錄因子。HoxD10在胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞分化和形態(tài)發(fā)育控制起重要作用，也是課題組前期通過CpG島和cDNA微陣列分析篩選到的可能與胃癌相關(guān)的新的候選基因，其

2、與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系需要深入研究。
　　 本研究將通過體內(nèi)外實驗明確HoxD10對胃癌生物學(xué)行為(細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移)的影響；探討并揭示胃癌HoxD10的基因啟動子是否被甲基化修飾及啟動子甲基化檢測對胃癌診治的潛在價值；采用表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選HoxD10基因調(diào)控的下游關(guān)鍵基因并進(jìn)行驗證，進(jìn)一步闡明HoxD10對胃癌抑制作用及相關(guān)凋亡信號通路的分子調(diào)控機(jī)制。
　　 研究步驟
　　 1.HoxD10在胃癌中的

3、表達(dá)及對胃癌的生物學(xué)行為的影響
　　 ①qPCR檢測33對胃癌及正常組織中HoxD10基因mRNA表達(dá)水平；PCR和Western blot檢測8種胃癌細(xì)胞株中的HoxD10的表達(dá)；
　　 ②克隆形成實驗和MTS實驗觀察過表達(dá)HoxD10對胃癌細(xì)胞增殖的影響；
　　 ③采用流式細(xì)胞儀分析HoxD10對胃癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響；Transwell實驗研究HoxD10對胃癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響；
　　 ④

4、裸鼠皮下荷瘤模型驗證過表達(dá)HoxD10對胃癌生長的影響。
　　 2.胃癌中HoxD10基因的啟動子甲基化研究及其對胃癌診治的潛在的價值
　　 ①對不同胃癌細(xì)胞株進(jìn)行了5-Aza-dC去甲基化處理，RT-PCR和Western blot分別檢測藥物處理前后HoxD10的表達(dá)情況；
　　 ②甲基化特異PCR(MSP)檢測不同胃癌細(xì)胞株啟動子甲基化情況；并檢測正常胃組織、胃癌前狀態(tài)和胃癌不同階段HoxD10啟動子甲基化

5、的頻度。
　　 3.HoxD10調(diào)控靶基因及凋亡相關(guān)信號通路的研究
　　 ①利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選HoxD10調(diào)控的下游靶基因。對其中9個候選靶基因在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HoxD10的MKN28胃癌細(xì)胞中進(jìn)行qPCR驗證；
　　 ②Western blot檢測HoxD10對IGFBP3和凋亡調(diào)控通路關(guān)鍵蛋白(caspase3和caspase8)表達(dá)的影響。
　　 研究結(jié)果
　　 1.HoxD10能抑制胃癌

6、的生長和侵襲
　　 ①HoxD10在胃癌組織中mRNA表達(dá)水平較正常組織明顯下調(diào)(P<0.001)，在系列胃癌細(xì)胞株中均呈現(xiàn)顯著低表達(dá)或沉默表達(dá)。
　　 ②過表達(dá)HoxD10能明顯抑制胃癌細(xì)胞株AGS和MKN28的增殖(p<0.01)。
　　 ③過表達(dá)HoxD10能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞周期S期，并顯著抑制AGS細(xì)胞的遷移和侵襲(p<0.01)。
　　 ④裸鼠胃癌移植瘤實驗發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HoxD10能顯著抑制

7、腫瘤的生長(p<0.01)。
　　 2.啟動子DNA甲基化是HoxD10表達(dá)下調(diào)的重要調(diào)控機(jī)制
　　 ①胃癌細(xì)胞株中HoxD10均呈下降或沉默表達(dá)，經(jīng)啟動子去甲基化(5-aza)藥物處理后HoxD10恢復(fù)表達(dá)或表達(dá)增強(qiáng)。
　　 ②MSP檢測發(fā)現(xiàn)HoxD10基因啟動子在3個胃癌細(xì)胞株(MKN28、MKN45和NCI-N87)中全部甲基化，在1個胃癌細(xì)胞株(AGS)中有部分甲基化。
　　 ③胃癌組織中HoxD

8、10啟動子甲基化頻度最高(85.7％，24/28)，胃癌前狀態(tài)(腸上皮化生)組織亦存在高頻度甲基化(60％，18/30)，正常組織無甲基化或低甲基化(0/10)。
　　 3.HoxD10調(diào)控多個重要下游基因，并參與相關(guān)凋亡信號通路調(diào)控
　　 ①篩選到HoxD10的下游調(diào)控基因：34個上調(diào)和50個下調(diào)基因。這些基因主要參與細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲等重要細(xì)胞生物學(xué)功能。qRT-PCR證實其中HCLS1、ANP32A、PDGFRL

9、、IGFBP3和CXCL9的mRNA水平明顯升高，而RAC2、NTS、KRT5和TUSC3的mRNA水平明顯下降，其結(jié)果與基因芯片表達(dá)譜吻合。
　　 ②過表達(dá)HoxD10后，AGS和MKN28細(xì)胞中IGFBP3表達(dá)水平明顯升高，Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase8的蛋白表達(dá)水平亦明顯升高。
　　 研究結(jié)論
　　 1.體內(nèi)外實驗證實HoxD10在胃癌中表達(dá)顯著下調(diào)，過表達(dá)HoxD10能

10、抑制胃癌生長和腫瘤侵襲。HoxD10有望成為新的胃癌抑制基因。
　　 2.發(fā)現(xiàn)HoxD10基因在胃癌中表達(dá)下調(diào)與啟動子DNA甲基化密切相關(guān)。HoxD10啟動子甲基化檢測有望作為胃癌前病變和癌變監(jiān)測的重要生物標(biāo)記物，HoxD10啟動子去甲基化有可能成為潛在的癌變干預(yù)手段。
　　 3.篩選到HoxD10調(diào)控的系列下游基因，這些基因參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)過程。并發(fā)現(xiàn)HoxD10具有上調(diào)IGFBP3候選靶基因，激活