EB病毒相關(guān)胃癌腫瘤相關(guān)基因表現(xiàn)遺傳學(xué)調(diào)節(jié)機制的研究.pdf

1、目的：明確EB病毒相關(guān)胃癌(EBV-associatedgastriccarcinoma,EBVaGC)WNT5A表觀遺傳學(xué)異常及其生物學(xué)意義。探討EBVaGC和EBV陰性胃癌(EBV-negativegastriccarcinoma,EBVnGC)組織中視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma,Rb)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforminggrowthfactorβ1,TGF-β1)基因啟動子甲基化狀態(tài)及蛋白表達(dá),探討EBV感

2、染與Rb,TGF-β1基因甲基化及蛋白表達(dá)的關(guān)系。
　　 方法：①選取5種EBV陽性和15種EBV陰性胃癌細(xì)胞系作為研究對象,RT-PCR檢測上述細(xì)胞系WNT5AmRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。②甲基化特異性PCR(Methylation-specificPCR,MSP)及亞硫酸氫鹽基因組測序法(Bisufitegenomicsequencing,BGS)檢測胃癌細(xì)胞系以及EBVaGC,EBV陰性胃癌(EBV-negativegastric

3、carcinoma,EBVnGC)和相應(yīng)癌旁組織中WNT5A編碼基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。③實時熒光定量PCR(RealtimequantitativePCR,realtimeqPCR)檢測去甲基化藥物作用前后EBV陽性細(xì)胞系和部分EBV陰性胃癌細(xì)胞系WNT5A表達(dá)。④構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-WNT5A轉(zhuǎn)染EBV陽性細(xì)胞系SUN719,WesternBlotting或RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后外源性WNT5A表達(dá)對β-Catenti

4、n,c-Jun和JunB蛋白以及ATF2,c-myc和EGFRmRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響。⑤采用甲基化特異性PCR(methylmion-specificPCR,MSP)對各種臨床病理指標(biāo)匹配的30例EBVaGC和38例EBVnGC組織中Rb和TGF-β1基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測。⑥免疫組化技術(shù)檢測兩種胃癌組織中Rb和TGF-β1蛋白的表達(dá)。⑦采用靶向LMP1的小干涉RNA和/或TGF-β1作用EBV陽性和陰性胃癌細(xì)胞系,RT-P

5、CR方法檢測LMP1相關(guān)因子MMP9,Survivin,CDK4,EGFR和ICAM-1轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
　　 結(jié)果：①RT-PCR結(jié)果顯示,EBV陰性細(xì)胞系WNT5A表達(dá)較為普遍,而EBV陽性細(xì)胞系中則表達(dá)缺失或下調(diào)。②MSP檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)5種EBV陽性細(xì)胞系中WNT5A編碼基因啟動子均表現(xiàn)為不同程度的甲基化,只有部分EBV陰性細(xì)胞系發(fā)生不同程度的甲基化。BGS檢測結(jié)果顯示,EBV陽性胃癌細(xì)胞系WNT5A編碼基因啟動子區(qū)49個CpG位

6、點甲基化率顯著高于EBV陰性胃癌細(xì)胞系,兩者間具有顯著性差異(F=305.414,P＜0.05)。③兩對特異性MSP引物(WNT5Am1/m2和WNT5Au1/u2;WNT5Am3/m4和WNT5Au3/u4)檢測23例EBVaGC和25例EBVnGCWNT5A啟動子甲基化狀態(tài),結(jié)果顯示,兩組間比較差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(WNT5Aml/m2∶X2=7.561,P=0.006:WNT5Am3/m4∶X2=5.298,P=0.0214)。兩對

7、特異性MSP引物檢測EBVaGC和EBVnGC及其匹配的癌旁組織中甲基化狀態(tài),EBVaGC和癌旁組織比較有顯著性差異(WNT5Am1/m2∶X2=18.050,P=0.000;WNT5Am3/m4∶X2=10.083,P=0.0015),而EBVnGC和癌旁組織比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義(WNT5Am1/m2∶X2=3.500,P=0.061;WNT5Am3/m4:X2=2.286,P=0.131)。④qPCR檢測結(jié)果顯示,去甲基化藥物Aza

8、作用EBV陽性胃癌細(xì)胞系SUN719可以重新激活WNT5A,恢復(fù)其表達(dá)。⑤重組質(zhì)粒pcDNA3.1-WNT5A轉(zhuǎn)染EBV陽性胃癌細(xì)胞系SNU719,WesternBlotting結(jié)果顯示,外源性WNT5A表達(dá)可以顯著抑制WNT/β-Catenin信號通路中β-Catenin表達(dá)。⑥與質(zhì)粒對照組及變異型WNT5A重組質(zhì)粒組比較,轉(zhuǎn)染野生型WNT5A重組質(zhì)粒的SUN719細(xì)胞c-Jun和c-myc表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化;而JunB表達(dá)明顯

9、升高,ATF2和EGFR轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著降低,差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。⑦EBVaGC和EBVnGC組織中Rb基因啟動子甲基化檢出率分別為80.0%(24/30)和50.0%(19/38),差異有顯著性(X2=6.490,P=0.011);EBVaGC和EBVnGC組織中TGF-β1啟動子基因甲基化檢出率分別為(50.0%,15/30)和(36.8%,14/38),差異無顯著性(X2=1.187,P=0.276)。⑧EBVaGC和

10、EBVnGC組織中Rb蛋白表達(dá)率分別為43.3%(13/30)和63.2%(24/38),TGF-β1蛋白表達(dá)率分別為56.7%(17/30)和63.2%(24/38),差異均無顯著性(Rb∶X2=2.656,P=0.103;TGF-β1∶X2=0.295,P=0.587)。胃癌組織中Rb和TGF-β1啟動子基因甲基化與其蛋白表達(dá)無明顯負(fù)相關(guān)(Rb∶X2=2.943,P=0.086,r=0.208;TGF-β1∶X2=3.051,P=0

11、.081,r=0.212)。胃癌組織中Rb啟動子基因甲基化、Rb蛋白表達(dá)缺失以及TGF-β1蛋白表達(dá)與病人年齡、性別、分化程度和腫瘤部位無相關(guān)性,但與腫瘤浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均＜0.05);TGF-β1啟動子基因甲基化與病人年齡、性別、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性,但與腫瘤浸潤深度和腫瘤部位相關(guān)(P均＜0.05)。⑨與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體組比較,siRNA-LMP1和siRNA-LMP1+TGF-β1轉(zhuǎn)染EBV陽性細(xì)胞GT38,

12、均可導(dǎo)致GT38細(xì)胞MMP9,Survivin和ICAM-1表達(dá)降低,而CDK4表達(dá)升高,差異均有顯著性(P均＜0.05);siRNA-LMP1+TGF-β1轉(zhuǎn)染組EGFR表達(dá)水平顯著高于對照組(P＜0.05),而siRNA-LMP1組與對照組比較無顯著性差異。⑩與對照組比較,TGF-β1作用可導(dǎo)致EBV陽性GT38細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)顯著降低,差異有顯著性(P＜0.05),而在EBV陽性細(xì)胞系SNU719和EBV陰性細(xì)胞系(SGC7

13、901和HGC-27)ICAM-1的表達(dá)無顯著差異;TGF-β1作用對4種細(xì)胞系MMP9,Survivin,CDK4和EGFRmRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)無明顯影響。
　　 結(jié)論:①EBV陰性細(xì)胞系中WNT5A的表達(dá)較為普遍,而在EBV陽性細(xì)胞系中則表達(dá)缺失或下調(diào),去甲基化試劑處理可誘使EBV陽性細(xì)胞系WNT5A的重新表達(dá),WNT5A編碼基因啟動子區(qū)高甲基化是EBV陽性細(xì)胞系WNT5A表達(dá)缺失或下調(diào)的重要機制。②EBVaGC組織中WNT5

14、A編碼基因啟動子區(qū)呈高甲基化狀態(tài),且其甲基化狀態(tài)明顯高于EBVnGC,提示W(wǎng)NT5A參與EBVaGC的發(fā)生發(fā)展,可能是EBVaGC重要的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志。③外源性WNT5A的表達(dá)可誘導(dǎo)EBV陽性細(xì)胞系SNU719中某細(xì)胞因子,如β-Catenin、JunB、ATF2、EGFR表達(dá)水平的變化,這些變化可以抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,提示W(wǎng)NT5A在EBVaGC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。④胃癌組織細(xì)胞中Rb基因異常甲基化較為常見,EBV可R