枯草芽孢桿菌谷氨酰t-RNA還原酶基因（hemA）和谷氨酰t-RNA合成酶基因（hemL）表達載體的構建及優(yōu)化.pdf

1、5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，簡稱ALA)是生物合成四吡咯的前體，而四吡咯是構成生物體必不可少的物質(zhì)。ALA對人畜無毒性，在環(huán)境中易降解、無殘留，是一種無公害的綠色農(nóng)用化學品。在醫(yī)學領域，ALA可作為抗癌藥物的中間體，作為檢驗鉛中毒的主要試劑。1999年12月，美國FDA正式批準ALA為治療皮膚癌前期的光動力藥物，ALA在治療其它表皮癌癥中的應用也得到了越來越多科學家的興趣。作為第二代光動力藥，ALA的顯

2、著優(yōu)點是副作用小、滲透性好、療效確切、對疾病的適用范圍廣及價格低等。 本研究以NCBI數(shù)據(jù)庫(M57676)的枯草芽抱桿菌基因組中的hemA和hemL基因序列為模板設計PCR引物，經(jīng)PCR擴增得到hemA和hemL基因片段，并克隆到pGEM-T-Vector載體上，得到重組質(zhì)粒pGEM-T-hemA和pGEM-T-hemL。酶切回收hemA和hemL基因片段并克隆到大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體(pGJ113)的Pglv啟動子下

3、游EcoRI和Not1位點間，構建hemA和hemL基因的表達載體pGJ216和pGJ218。將兩個表達載體分別電轉化至B.subtilis 1A747感受態(tài)細胞中，用麥芽糖進行誘導表達，SDS-PAGE凝膠掃描分析顯示，目標蛋白HemA和HemL分別占胞內(nèi)總可溶性蛋白的11％和13％，實現(xiàn)了hemA和hemL基因的高效表達。重組菌B.subtilis(pGJ216)和B. subtilis(pGJ218)的發(fā)酵液上清中5-氨基乙酰丙酸

4、含量分別達到26.31 mg/L和24.47mg/L，菌液呈紅色，紫外分光光度檢測驗證顯色的為卟啉類物質(zhì)。試驗表明，表達的重組蛋白具有生理活性并促進了枯草芽孢桿菌中5-氨基乙酰丙酸的合成，并且分解代謝途徑也加快。 對構建的表達載體pGJ216和pGJ218進行優(yōu)化，將突變的Pglv啟動子-PglvM分別克隆到pGJ216和pGJ218中hemA和hemL基因的上游，替換Pglv啟動子，得到表達載體pGJ216M和pGJ218M，

5、將其電轉化至B. subtilis 1A747感受態(tài)細胞中，用麥芽糖進行誘導表達。SDS-PAGE電泳分析顯示，pGJ216M和pGJ218M的表達蛋白在50 KD附近有一條明顯的條帶，而對照菌沒有明顯的蛋白條帶，結果表明得到較大量的谷氨酰t-RNA還原酶蛋白和谷氨酰t-RNA合成酶蛋白，并且在枯草芽孢桿菌中實現(xiàn)了高效表達。優(yōu)化后的表達載體pGJ216M和pGJ218M比表達載體pGJ216和pGJ218的誘導表達效果更好，生成的5-氨