地衣芽孢桿菌聚γ-谷氨酸合成酶復(fù)合體基因的克隆表達(dá)及發(fā)酵調(diào)控.pdf

1、聚γ-谷氨酸(poly—γ-glutamic acid,γ-PGA)是由L-和(或)D-谷氨酸單體通過)γ-谷氨酰鍵連接形成的一種非核糖體多肽,具有生物可降解性和良好的吸水性,作為環(huán)境友好型生物高聚物具有廣泛的應(yīng)用前景。由于γ-PGA結(jié)構(gòu)的多樣性、合成的多樣性、代謝調(diào)控的復(fù)雜性以及γ-PGA合成酶的不穩(wěn)定性,到目前為止,對其生物合成機(jī)制還沒有形成共識。
　　 地衣芽孢桿菌WBL-3(Bacillus licheniformis

2、WBL-3)是一種谷氨酸依賴型γ-PGA產(chǎn)生菌。本文根據(jù)B.licheniformis14580設(shè)計引物,從B.licheniformis WBL-3中克隆得到γ-PGA合成酶復(fù)合體基因pgsBCA(登錄號:GQ249184),與B.licheniformis14580pgsBCA基因的同一性為97％,與Bacillus subtilis IF03336 pgsBCA基因的同一性只有74％。將pgsBCA基因克隆至表達(dá)載體pTrc99A

3、,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pTrc-pgs,將其轉(zhuǎn)化Escherichia coliJM109得到基因工程菌E.col JMi-pgs。對E.coli JM—pgs進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA,E.coli JM-pgs能產(chǎn)生胞外γ-PGA,產(chǎn)量為8.624 g／L。推測B.licheniformis WBL-3與Bacillus subtilis IFO3336有相似的γ-PGA催化機(jī)制,即由聚γ-谷氨酸合成酶單個酶催化合成。
　　 聚γ-谷氨

4、酸(γ-PGA)及其衍生物是一種新型土壤修復(fù)和改良材料,能吸附土壤中的重金屬和放射性核物質(zhì)等污染物,也可作為保水材料應(yīng)用于干旱環(huán)境以及化妝品領(lǐng)域。NaCl、Mn(Ⅱ)、L-谷氨酰胺和α-酮戊二酸四因素對B.licheniformis WBL-3合成γ-PGA產(chǎn)量及分子量有重要影響。分別用L-谷氨酰胺和α-酮戊二酸代替L-谷氨酸,B0licheniformis WBL-3未產(chǎn)生γ-PGA,說明B.licheniformis WBL-3為嚴(yán)

5、格的谷氨酸依賴型產(chǎn)生菌。以NaCl(0～7％),Mn(Ⅱ)(0-400μM),L-谷氨酰胺(0～2.0 mM),α-酮戊二酸(0～20 mM)進(jìn)行單因素試驗,表明:γ-PGA產(chǎn)量均隨四因素濃度的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,γ-PGA產(chǎn)量分別在NaCl,Mn(Ⅱ)、L-谷氨酰胺和α-酮戊二酸濃度為6％(w／v),100μM,1.5 mM和10 mM時達(dá)到最大值35.79g／L,24.77 g／L,30.07 g／L和26.09 g／L；γ