2677.異源d海因酶和n氨甲酰水解酶共表達重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建

1、異源異源D海因酶和海因酶和N氨甲酰水解酶共表達重組氨甲酰水解酶共表達重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建枯草芽孢桿菌的構(gòu)建ConstructionofrecombinantBacillussubtilisbycoexpressionofheterologousDhydantoinaseNcarbamoylase學(xué)科專業(yè)：生物化工研究生：王亞盟指導(dǎo)教師：班睿副教授天津大學(xué)化工學(xué)院二零一六年五月摘要D對羥基苯甘氨酸是半合成β內(nèi)酰胺類抗生素的重要原料，海因

2、酶法是普遍采用的D對羥基苯甘氨酸工業(yè)生產(chǎn)方法。海因酶法就是采用D海因酶和N氨甲酰水解酶催化DL對羥基苯海因，轉(zhuǎn)化為D對羥基苯甘氨酸的生物化學(xué)方法。本文以枯草芽孢桿菌為受體菌，共表達異源的D海因酶和N氨甲酰水解酶，作為海因酶法合成D對羥基苯甘氨酸的全細胞催化劑。本文對于D海因酶的選擇、重組菌的構(gòu)建和影響全細胞催化活性的一些重要因素進行了研究。采用Paco表達盒誘導(dǎo)表達D海因酶基因（sd1或hyd），采用PAE表達盒表達N氨甲酰水解酶基因（

3、adc）。以質(zhì)粒pHP13為載體，分別構(gòu)建PAEadcPacosd1基因和PAEadcPacohyd基因共表達質(zhì)粒pHCY和pHCS?？莶菅挎邨U菌168pHCY和168pHCS的全細胞催化活性，分別為0.25UmL和0.36UmL。在枯草芽孢桿菌168N的染色體上，整合表達ac基因和sigL基因，構(gòu)建了重組菌株WD3。qRTPCR分析顯示，WD3菌株胞內(nèi)ac和sigL基因的mRNA水平平均提高了248.2倍和80.7倍，表明ac和sig

4、L基因在WD3菌株中被過表達。WD3pHCS菌株的全細胞催化活性達到0.56UmL，比168pHCS提高了80%。結(jié)果表明，提高激活蛋白Ac和σL因子的胞內(nèi)水平，對于維持多拷貝Paco表達盒的正常轉(zhuǎn)錄功能是必要的。以pUB110質(zhì)粒為基礎(chǔ)，構(gòu)建了adcsd1共表達重組質(zhì)粒pUCS。WD3pUCS全細胞催化活性達到0.98UmL，比WD3pHCS的0.56UmL提高了75%。結(jié)果表明，提高adc和sd1基因劑量，對于提高重組菌的全細胞催化

5、活性是有效的。敲除WD3菌株的sdp和skf基因，構(gòu)建雙缺陷株WD5。WD5pUCS菌株與WD3pUCS相比，全細胞催化活性相當(dāng)；但是在培養(yǎng)體系和催化反應(yīng)體系中，芽孢量會高一個數(shù)量級；在反應(yīng)體系中，全細胞催化活性的衰減速率顯著降低。因此，sdp和skf基因缺陷，雖然導(dǎo)致更多的細胞形成芽孢，但是由于消除了姊妹細胞之間的自相殘殺，而有利于全細胞催化活性的維持。敲除WD5菌株的kinA和kinB基因，構(gòu)建重組菌WD7。WD7pUCS完全不形成