2677.異源d海因酶和n氨甲酰水解酶共表達(dá)重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建

1、異源異源D海因酶和海因酶和N氨甲酰水解酶共表達(dá)重組氨甲酰水解酶共表達(dá)重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建枯草芽孢桿菌的構(gòu)建ConstructionofrecombinantBacillussubtilisbycoexpressionofheterologousDhydantoinaseNcarbamoylase學(xué)科專業(yè)：生物化工研究生：王亞盟指導(dǎo)教師：班睿副教授天津大學(xué)化工學(xué)院二零一六年五月摘要D對(duì)羥基苯甘氨酸是半合成β內(nèi)酰胺類抗生素的重要原料，海因

2、酶法是普遍采用的D對(duì)羥基苯甘氨酸工業(yè)生產(chǎn)方法。海因酶法就是采用D海因酶和N氨甲酰水解酶催化DL對(duì)羥基苯海因，轉(zhuǎn)化為D對(duì)羥基苯甘氨酸的生物化學(xué)方法。本文以枯草芽孢桿菌為受體菌，共表達(dá)異源的D海因酶和N氨甲酰水解酶，作為海因酶法合成D對(duì)羥基苯甘氨酸的全細(xì)胞催化劑。本文對(duì)于D海因酶的選擇、重組菌的構(gòu)建和影響全細(xì)胞催化活性的一些重要因素進(jìn)行了研究。采用Paco表達(dá)盒誘導(dǎo)表達(dá)D海因酶基因（sd1或hyd），采用PAE表達(dá)盒表達(dá)N氨甲酰水解酶基因（

3、adc）。以質(zhì)粒pHP13為載體，分別構(gòu)建PAEadcPacosd1基因和PAEadcPacohyd基因共表達(dá)質(zhì)粒pHCY和pHCS?？莶菅挎邨U菌168pHCY和168pHCS的全細(xì)胞催化活性，分別為0.25UmL和0.36UmL。在枯草芽孢桿菌168N的染色體上，整合表達(dá)ac基因和sigL基因，構(gòu)建了重組菌株WD3。qRTPCR分析顯示，WD3菌株胞內(nèi)ac和sigL基因的mRNA水平平均提高了248.2倍和80.7倍，表明ac和sig

4、L基因在WD3菌株中被過(guò)表達(dá)。WD3pHCS菌株的全細(xì)胞催化活性達(dá)到0.56UmL，比168pHCS提高了80%。結(jié)果表明，提高激活蛋白Ac和σL因子的胞內(nèi)水平，對(duì)于維持多拷貝Paco表達(dá)盒的正常轉(zhuǎn)錄功能是必要的。以pUB110質(zhì)粒為基礎(chǔ)，構(gòu)建了adcsd1共表達(dá)重組質(zhì)粒pUCS。WD3pUCS全細(xì)胞催化活性達(dá)到0.98UmL，比WD3pHCS的0.56UmL提高了75%。結(jié)果表明，提高adc和sd1基因劑量，對(duì)于提高重組菌的全細(xì)胞催化

5、活性是有效的。敲除WD3菌株的sdp和skf基因，構(gòu)建雙缺陷株WD5。WD5pUCS菌株與WD3pUCS相比，全細(xì)胞催化活性相當(dāng)；但是在培養(yǎng)體系和催化反應(yīng)體系中，芽孢量會(huì)高一個(gè)數(shù)量級(jí)；在反應(yīng)體系中，全細(xì)胞催化活性的衰減速率顯著降低。因此，sdp和skf基因缺陷，雖然導(dǎo)致更多的細(xì)胞形成芽孢，但是由于消除了姊妹細(xì)胞之間的自相殘殺，而有利于全細(xì)胞催化活性的維持。敲除WD5菌株的kinA和kinB基因，構(gòu)建重組菌WD7。WD7pUCS完全不形成