中藥抗肺癌反應(yīng)性基因研究及中醫(yī)綜合治療臨床研究方法探討.pdf

1、肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，2002年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，估計有1352132新發(fā)病例和1178918人死亡(WHO2002)。發(fā)病率發(fā)達國家多于發(fā)展中國家，在腫瘤患者中，男性肺癌占30.9％，女性占12.6％。近年來，肺癌發(fā)病率在我國增長很快，2002年我國肺癌發(fā)病在男性為269650人，女性為126718人(WHO2002)。Meta分析顯示化療對非小細胞肺癌治療不敏感。沒有足夠的證據(jù)表明，任何放療方案對非小細胞肺癌有較

2、大的緩解，大劑量帶來更多的毒性作用，體能狀況較好的病人給予大劑量可適當(dāng)增加生存期(1年6％，2年3％)。術(shù)后放療對早期完全切除的非小細胞肺癌是有害的，不能做為此類患者的常規(guī)治療，對N2腫瘤的治療作用還不清楚。提高肺癌療效的措施是多學(xué)科綜合治療，其中中醫(yī)藥治療占有重要地位。　　中藥抗腫瘤反應(yīng)性基因研究部分選擇基礎(chǔ)研究比較充分，臨床應(yīng)用多年的中藥康萊特注射液(薏苡仁脂的靜脈油乳劑)，進行其抗LA795肺腺癌小鼠肺轉(zhuǎn)移的中藥反應(yīng)性基因研究。

3、本研究是國家自然科學(xué)基金項目(30070957)：薏苡仁脂抗腫瘤轉(zhuǎn)移反應(yīng)性基因研究的第二部分，并根據(jù)前期中藥抗癌癥惡病質(zhì)基因芯片研究(國家中醫(yī)藥管理局課題)實驗結(jié)果，篩選出三張芯片差異表達基因27條，表達增高基因25條，表達降低的基因2條。兩張芯片的差異表達基因52條。接種部位瘤組織差異表達基因14條，共93條差異表達基因。文獻檢索發(fā)現(xiàn)約21條差異表達基因與腫瘤相關(guān)，其中多與腫瘤免疫相關(guān)，進一步檢索腫瘤免疫相關(guān)基因37條，加入看家基因2

4、0條，定制含150條50-mer基因的康萊特中藥反應(yīng)性相關(guān)基因寡核苷酸圍欄芯片，評價康萊特注射液對LA795肺腺癌小鼠基因表達的影響，通過實驗來研究康萊特抑制腫瘤的分子機制及尋找潛在的新的一些治療靶點?！　∈紫冗M行康萊特的抑瘤實驗，觀察康萊特組體重增加最多，環(huán)磷酰胺組體重增加較少，有比較顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)?？等R特組和荷瘤對照組體重增加差異不顯著，但由于荷瘤對照組小鼠瘤體較大，小鼠凈重康萊特組最大，環(huán)磷酰胺組其次，荷瘤對照組

5、最小。實驗首先重復(fù)LA795肺腺癌轉(zhuǎn)移模型，康萊特抑瘤率為66.92％，與荷瘤對照組比較，具有非常顯著性差異(P＜0.01)，與環(huán)磷酰胺比較無明顯差異，繪制腫瘤生長曲線?？等R特組肺轉(zhuǎn)移率為93.3％，但轉(zhuǎn)移灶以Ⅱ組居多；與對照組比較差異非常顯著(P＜0.01)?？等R特組與環(huán)磷酰胺組比較，無明顯差異(P＞0.05)。　　選擇北京博奧生物芯片有限責(zé)任公司的寡核苷酸(Oligo)芯片技術(shù)，點制成每基因50個核苷的圍欄芯片，即挑選的150個基

6、因在每張玻片上共點制成4個亞陣，每個亞陣包括450個基因(即150個基因重復(fù)點三次)，每個亞陣可以獨立為一對樣本(對照樣本和實驗樣本)進行雜交反應(yīng)。正常對照組、荷瘤對照組肺組織分別混合，康萊特隨機取三只小鼠肺組織，分別提取mRNA。以定制的Oligo芯片進行雜交反應(yīng)、熒光標(biāo)記，并進行熒光交換，即在芯片上每個基因重復(fù)3次，熒光交換處理以后每個基因會有6次重復(fù)結(jié)果，用t-檢驗的方法挑選差異基因?！　≡?5％顯著性水準(zhǔn)上為顯著差異，整理出康

7、萊特三張芯片相同差異表達基因，差異大于1.5倍以上，且趨勢一致基因10條，其中表達上調(diào)8條，分別是AA051577、AW549803、M63244、M75721、NM007606、NM008302、NM_025567、X66032；下調(diào)2條，分別是AF184981、U13921。與正常對照組比較，趨勢一致的基因有5條，分別是AF184981、AW549803、NM007606、NM008302、NM025567。其中：腫瘤抑制基因cyc

8、linB2在康萊特用藥后三組實驗中均表達上調(diào)，考慮cyclinB2在G2/M期大量表達，阻滯細胞周期中G2/M時相細胞，減少有絲分裂，從而抑制腫瘤細胞增殖。鼠的CyclinB2促進劑受細胞周期依賴素(CDC)的調(diào)節(jié)，cdc2促進細胞轉(zhuǎn)移明確地與cyclinB2相關(guān)?？等R特促進cyclinB2表達，有可能抑制cdc2表達，進而抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。與荷瘤對照組相比，腫瘤轉(zhuǎn)移受到抑制的康萊特治療組KLT1、KLT2、KLT3的alpha-1P

9、I-1分別上調(diào)為1.7786，2.1292和1.1629，而在正常對照組沒有差異表達，并經(jīng)實時定量RT-PCR證實。說明康萊特具有促進alpha-1蛋白抑酶基因表達的作用，可能進而抑制腫瘤生長。IL-1在三組樣品中均表達下調(diào)為0.7314，0.7509，0.7179，而正常對照組表達下調(diào)為0.4451，說明康萊特具有一定的恢復(fù)腫瘤惡病質(zhì)升高的IL-1水平的作用，但未能恢復(fù)至正常水平。同時，康萊特抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移可能是通過上調(diào)alpha-

10、1水平，作為體液抑制劑來抵抗IL-1的產(chǎn)生。康萊特具有恢復(fù)細胞色素C、等至正常水平的作用，可能通過誘導(dǎo)細胞色素C的釋放來抑制T細胞調(diào)亡，進而提高抗腫瘤免疫、?？等R特具有恢復(fù)碳酸脫水酶3至正常水平，下調(diào)FMO2的表達，可能通過這一機制改善機體的新陳代謝，抑制腫瘤，緩解腫瘤惡病質(zhì)狀態(tài)?！　∨R床部分考慮到辨證施治是中醫(yī)的特色，即需要根據(jù)患者的具體證候，而不是根據(jù)腫瘤的病理類型決定采用何種治療方案。在確定了治療方案后，中醫(yī)還要對方劑進行加減，

11、不同患者的治療差異很大。因此研究過程中處理因素難以統(tǒng)一，從而造成試驗可重復(fù)性差，隨機對照實驗(RCT)難以進行。醫(yī)生需根據(jù)患者的不同證候開具不同配伍中藥，研究中也很難遵循盲法的試驗設(shè)計原則?！　「鶕?jù)中醫(yī)藥治療腫瘤的特點，特別是導(dǎo)師提出的中醫(yī)綜合治療腫瘤的理論，針對晚期非小細胞肺癌，利用計算機SQLsever數(shù)據(jù)庫技術(shù)，設(shè)計晚期非小細胞肺癌臨床病例分析數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，從實在病例中抽取實際治療的東西，反應(yīng)臨床實際治療的情況，總結(jié)中醫(yī)綜合治療腫

12、瘤的特點，特別是中醫(yī)辨證論證的特色。避免一方一藥人為地設(shè)計實驗方案進行臨床實驗存在的種種弊端，希望借此研究，拋磚引玉，探索一條新的臨床研究方法?！　∑渲斜孀C論證有效方藥部分，為了體現(xiàn)不同醫(yī)師經(jīng)驗的程度不同，采用加權(quán)的方法，主任醫(yī)師×3，副主任醫(yī)師×2，主治醫(yī)師及醫(yī)師×1。隨訪102例患者中，存活8例，中位生存期11月(6月-38月)，1年生存率為35.3％。其中研究生期間臨床系統(tǒng)觀察的32例患者中位生存期為11.5月(6.2月-24.

13、5月)，1年生存率為37.5％。中醫(yī)綜合治療后卡氏評分較前增加，體重穩(wěn)定，可有效改善患者神疲乏力、少氣懶言、氣短、咳嗽、痰多、疼痛、納谷少馨、痰中帶血、大便干結(jié)、口干咽燥、便溏、腹脹、腰膝酸軟等癥候。其中神疲乏力、少氣懶言、咳嗽、痰多、疼痛、納谷少馨、痰中帶血、大便干結(jié)、便溏等癥候的改善與治療前比較，具有非常顯著的意義(P＜0.01)；氣短、口干咽燥、腹脹、腰膝酸軟等癥候的改善與治療前比較，具有顯著的差異(P＜0.05)。可以有效改善食

14、欲、精神、疲乏、疼痛、自身對癌癥的認(rèn)識、對治療的態(tài)度等。精神、疲乏、疼痛具有非常顯著性差異(P＜0.01)。食欲、自身對癌癥的認(rèn)識、對治療的態(tài)度具有顯著性差異(P＜0.05)。提高CD4、CD4/CD8、NK細胞活性。CD4與治療前相比，具有顯著性差異(P＜0.05)，CD4/CD8、NK細胞活性與治療前相比，具有非常顯著性差異(P＜0.01)?！　挠嬎銠C分析結(jié)果可以看出，辨證分型中肺氣虛約占32.4％；脾氣虛約占31.4％；肺陰虛

15、約占28.2％；腎陰虛14.7％；痰濕40.2％；瘀血約占20.6％。以方測證進行辨證治則統(tǒng)計，扶正為主約占60.8％，祛邪為主約占39.2％，補氣約占34.3％，潤肺約占33.3％，健脾約占37.3％，滋腎約占14.7％，祛痰約占34.3％，化瘀約占17.6％，止咳約占17.6％，清熱約占29.4％。分析晚期非小細胞肺癌正虛邪實是其基本病機，且以正虛為主，正虛之中又多表現(xiàn)為肺氣虛、肺陰虛、脾氣虛及腎陰虛。邪實則為痰濕、瘀血，為本虛標(biāo)實