中間普氏菌增殖機(jī)制及對(duì)慢性牙周炎致病作用的研究.pdf

1、慢性牙周炎是牙周組織的慢性感染性疾病，其特點(diǎn)是牙周組織破壞，牙周袋形成、牙槽骨吸收，最終導(dǎo)致牙齒喪失。大量證據(jù)表明牙菌斑生物膜中的革蘭氏陰性菌如牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌等是引起牙周炎的始動(dòng)因子。這些牙周致病菌在齦下環(huán)境中定植、繁殖，產(chǎn)生內(nèi)毒素、蛋白酶等毒性物質(zhì)直接破壞牙周組織；同時(shí)還可引發(fā)一系列的宿主免疫反應(yīng)，產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)，間接導(dǎo)致牙周結(jié)締組織破壞、牙槽骨吸收。
　　中間普氏菌是革蘭氏陰性產(chǎn)黑色素專性厭養(yǎng)桿菌，該菌與急性壞死

2、性潰瘍性牙齦炎、慢性牙周炎、牙周膿腫以及妊娠性牙齦炎的發(fā)病密切相關(guān)。此外，中間普氏菌還是壞疽性口炎以及肺部感染的重要致病菌，其主要致病因子包括脂多糖、凝集素、纖毛、囊泡、蛋白水解酶等。
　　鐵是微生物生存和繁殖所必不可少的一種營(yíng)養(yǎng)元素，鐵參與多種生物過(guò)程：如光合作用、呼吸作用、氧的轉(zhuǎn)運(yùn)、基因調(diào)控以及DNA生物合成等。在宿主內(nèi)，由于鐵被包含于血黃素、血紅素結(jié)合蛋白、以及含血紅素的蛋白（血紅蛋白和肌紅蛋白）細(xì)胞內(nèi)，或被轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋

3、白結(jié)合；此外，游離的血紅素又迅速被血液結(jié)合素和白蛋白結(jié)合，使得游離鐵濃度極低，約為10-18μM，遠(yuǎn)低于細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需要的0.05-0.5μM。因此，細(xì)菌能否從鐵受限的環(huán)境中攝取足夠的鐵以維持其生長(zhǎng)繁殖是其重要的毒力因子。
　　鐵是中間普氏菌的必需營(yíng)養(yǎng)素，但由于該菌不能合成血紅素，因此必須從宿主內(nèi)攝取鐵以維持其生長(zhǎng)。迄今為止，對(duì)該菌的鐵攝取機(jī)制以及鐵對(duì)其病原性影響的研究甚少。有研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎部位齦溝液內(nèi)的鐵含量明顯高于正?；螨l

4、炎部位齦溝液中的鐵含量，有學(xué)者認(rèn)為齦溝液內(nèi)主要的鐵源可能是紅細(xì)胞溶解所釋放的血紅蛋白（hemoglobin,Hb）。中間普氏菌釋放大量的凝血及溶血因子，可使紅細(xì)胞凝集、溶解、Hb釋放。近期有研究報(bào)道Hb作為唯一的鐵源可以促進(jìn)該菌的增殖，但對(duì)于該菌從Hb攝取鐵的機(jī)制尚無(wú)研究報(bào)道。因此本研究將就中間普氏菌利用Hb鐵的可能機(jī)制進(jìn)行探討。
　　細(xì)菌在體內(nèi)的生長(zhǎng)繁殖是其致病的首要條件，但細(xì)菌所引發(fā)的一系列宿主反應(yīng)是導(dǎo)致組織破壞的主要因素。牙

5、周炎時(shí)，宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)和其他蛋白酶在牙周組織的破壞中起重要作用。MMP是一組鋅和鈣依賴性蛋白酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix,ECM）和基底膜成分。MMP廣泛參與各種生理功能，如形態(tài)發(fā)生、組織改建、創(chuàng)傷愈合、宿主防御和免疫調(diào)控等。在病理性疾病如腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和慢性牙周炎的發(fā)病中也起重要作用。大量研究表明，與牙周健康部位相比，牙周炎

6、部位的齦溝液以及牙周組織中多種MMP水平明顯升高，提示MMP與牙周炎密切相關(guān)。
　　目前關(guān)于牙周膜成纖維細(xì)胞的研究相對(duì)較少。牙周膜成纖維細(xì)胞不僅在牙周膜的形成和維持中起重要作用，也在相鄰組織牙槽骨和牙骨質(zhì)的修復(fù)、重建和再生中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)中間普氏菌可誘導(dǎo)人牙齦上皮細(xì)胞和牙周膜細(xì)胞表達(dá)炎性細(xì)胞因子，但關(guān)于中間普氏菌對(duì)MMP表達(dá)調(diào)控作用的研究甚少，迄今尚無(wú)中間普氏菌對(duì)牙周組織細(xì)胞MMP調(diào)控作用的研究報(bào)道，因此本研究將就中間普氏菌

7、對(duì)人牙周膜細(xì)胞(humanperiodontalligamentcells,hPDLc)分泌MMP的作用進(jìn)行探討，同時(shí)探討絲裂原激活的蛋白激酶（mitogenactivatedproteinkinase,MAPK）信號(hào)系統(tǒng)在中間普氏菌誘導(dǎo)的MMP表達(dá)中的調(diào)控作用，以期揭示中間普氏菌在牙周炎發(fā)生中的致病機(jī)制。本研究的主要結(jié)果如下：
　　1.中間普氏菌對(duì)Hb的利用及其鐵攝取機(jī)制
　　1.1利用細(xì)菌培養(yǎng)方法，證實(shí)中間普氏菌可有效利

8、用Hb作為其鐵源。斑點(diǎn)印跡結(jié)果顯示，中間普氏菌細(xì)胞可與Hb結(jié)合，兩者的結(jié)合受pH影響，在弱酸性環(huán)境中的結(jié)合強(qiáng)度高于弱堿性環(huán)境。pH5.0時(shí)，中間普氏菌與Hb的結(jié)合能力最強(qiáng)。
　　1.2利用batch親和層析和SDS-PAGE方法鑒定出與Hb結(jié)合的中間普氏菌外膜蛋白。通過(guò)綜合運(yùn)用陰離子層析、Hb凝膠親和層析和羥基磷灰石層析等蛋白質(zhì)純化技術(shù)，純化出與Hb結(jié)合的60kDa外膜蛋白。
　　1.360kDa血紅蛋白結(jié)合蛋白（hemog

9、lobin-bindingprotein,HBP）與Hb的結(jié)合受pH影響，pH5.0時(shí)，HBP與Hb的結(jié)合能力最強(qiáng)。表面等離子共振技術(shù)對(duì)HBP和Hb相互作用的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，兩者之間的的解離系數(shù)為1.48×10-8M，提示HBP特異性與Hb結(jié)合。
　　1.4抑制性研究結(jié)果表明珠蛋白可顯著抑制HBP與Hb的結(jié)合，而血紅素、過(guò)氧化氫酶以及細(xì)胞色素C對(duì)兩者的結(jié)合沒(méi)有影響，提示Hb的珠蛋白結(jié)構(gòu)域而非血紅素結(jié)構(gòu)域參與了HBP與Hb的結(jié)合。

10、
　　1.5由于HBP的氨基端被封閉，未能夠測(cè)出HBP氨基端的氨基酸序列。利用凝膠內(nèi)消化和逆相HPLC技術(shù)將HBP分離為肽片段，測(cè)定了數(shù)個(gè)肽片段的氨基酸序列。將所得到的氨基酸序列進(jìn)行檢索，未發(fā)現(xiàn)這些序列與已知的HBP具有同源性，提示中間普氏菌HBP可能為新發(fā)現(xiàn)的一種HBP。
　　1.6鐵的限制對(duì)HBP的表達(dá)無(wú)明顯影響，提示HBP為組成性表達(dá)的蛋白；鐵限制對(duì)中間普氏菌與Hb的結(jié)合能力也無(wú)明顯影響。
　　1.7利用SDS-

11、PAGE技術(shù)檢測(cè)中間普氏菌對(duì)Hb的降解并利用掃描密度儀對(duì)降解作用進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)中間普氏菌對(duì)Hb的降解具有時(shí)間依賴效應(yīng)且該降解作用受pH影響，pH5.0時(shí)降解作用最強(qiáng)。抑制性研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)參與Hb降解的可能是一種半胱氨酸蛋白酶。鐵的限制對(duì)中間普氏菌的Hb降解作用沒(méi)有影響，提示該半胱氨酸蛋白酶為組成性表達(dá)。
　　2.中間普氏菌對(duì)hPDLcMMP表達(dá)的調(diào)控作用
　　2.1RT-PCR結(jié)果顯示，hPDLc組成性表達(dá)MMP-1、-2

12、、-3、-14、TIMP-1和TIMP-2。中間普氏菌培養(yǎng)上清刺激hPDLc6h后，可誘導(dǎo)MMP-9、上調(diào)MMP-1和TIMP-1、下調(diào)TIMP-2mRNA的表達(dá)，對(duì)其他MMPmRNA表達(dá)無(wú)影響。
　　2.2明膠酶譜結(jié)果顯示，中間普氏菌培養(yǎng)上清可濃度依賴性地誘導(dǎo)hPDLc分泌MMP-9，該誘導(dǎo)作用具有時(shí)間依賴效應(yīng)；但對(duì)MMP-2的分泌無(wú)調(diào)控作用。
　　2.3利用ELISA技術(shù)檢測(cè)了其他MMP的分泌，發(fā)現(xiàn)中間普氏菌培養(yǎng)上清可濃

13、度依賴性地增強(qiáng)MMP-1和TIMP-1的分泌、降低TIMP-2的分泌，該作用具有時(shí)間效應(yīng)。對(duì)MMP-3的分泌無(wú)影響。
　　2.4MAPK信號(hào)通路在在中間普氏菌誘導(dǎo)的MMP分泌中起不同調(diào)控作用：ERK、JNK和p38抑制劑對(duì)中間普氏菌誘導(dǎo)的MMP-9分泌無(wú)任何調(diào)控作用；ERK、JNK和p38抑制劑顯著抑制中間普氏菌對(duì)MMP-1的促分泌作用；ERK和JNK抑制劑顯著抑制中間普氏菌對(duì)TIMP-1的促分泌作用，但p38抑制劑對(duì)中間普氏菌的

14、促TIMP分泌作用無(wú)抑制效果；JNK和p38抑制劑逆轉(zhuǎn)了中間普氏菌對(duì)TIMP-2的抑制作用；所有MAPK抑制劑均對(duì)MMP-3的分泌無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論
　　中間普氏菌可有效利用Hb作為其鐵源，該菌從Hb攝取鐵的可能機(jī)制是：首先細(xì)胞外膜的60kDaHBP與Hb特異性結(jié)合，然后結(jié)合的Hb被該菌產(chǎn)生的半胱氨酸蛋白酶降解，從而使包含于Hb內(nèi)的血紅素釋放以供其利用。有效的鐵攝取機(jī)制保障了中間普氏菌在體內(nèi)的定植和繁殖。
　　中間