拮抗腹瀉致病菌乳酸菌的篩選及其作用機(jī)制研究.pdf

1、腹瀉是世界范圍內(nèi)引起嬰幼兒死亡最常見(jiàn)的疾病。目前治療腹瀉的藥物大多為抗生素，經(jīng)常服用這些藥物不僅會(huì)破壞正常腸道菌群，也不能夠徹底將腸道中的致病菌殺死，因而常常會(huì)復(fù)發(fā)。近年來(lái)人們對(duì)于益生菌治療致病菌引起腹瀉的興趣越來(lái)越廣泛，但是對(duì)其機(jī)理并不是很明了。本論文篩選能夠抑制致病菌生長(zhǎng)和黏附的乳桿菌，對(duì)于乳桿菌的腸道生存能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并且對(duì)乳桿菌抑制致病菌黏附、生長(zhǎng)和侵入的機(jī)理進(jìn)行了研究。
　　本論文主要篩選能夠抑制引起腹瀉致病菌生長(zhǎng)和黏

2、附的乳桿菌，并且對(duì)其適應(yīng)腸道環(huán)境：耐酸、耐膽鹽和黏附性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。從中國(guó)西部地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵食品以及人類糞便樣品中分離的170株潛在乳桿菌作為篩選菌株。對(duì)這170株乳桿菌進(jìn)行初篩，篩選出抑菌能力較強(qiáng)的44株乳桿菌。以鼠李糖乳桿菌 L.GG的抑菌能力作為參照對(duì)這44株乳酸菌進(jìn)行篩選，最終篩選出14株抑菌圈直徑大于15 mm，并且能夠同時(shí)抑制鼠傷寒沙門(mén)氏菌、宋內(nèi)志賀氏菌和艱難梭菌的乳酸菌菌株。對(duì)這14株乳酸菌進(jìn)行抑制致病菌黏附的篩選，最終篩選出

3、7株使致病菌黏附數(shù)量降低到2×104 CFU/mL的乳酸菌，然后對(duì)其進(jìn)行腸道生存能力評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這7株乳桿菌在pH2的條件下處理2 h后存活的乳酸菌依然能夠達(dá)到107 CFU/mL左右，而在0.3％的膽鹽環(huán)境中處理2 h后菌數(shù)降低到原來(lái)的百分之一。單層細(xì)胞上黏附的乳桿菌數(shù)量 J5、G15和F0533能夠達(dá)到106 CFU/mL，顯示了較強(qiáng)的黏附能力。經(jīng)過(guò)綜合分析評(píng)價(jià)篩選出F0533、IN4125、G15、J5和M7這5株乳酸菌進(jìn)行

4、后續(xù)機(jī)理的研究。運(yùn)用16 S rDNA基因技術(shù)和BIOLOG鑒定五株乳酸菌 F0533、IN4125、G15、J5和M7分別為L(zhǎng)actobacillus rhamnosus、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus casei和Lactobacillus paracasei。
　　這5株乳桿菌從競(jìng)爭(zhēng)、排除和取代三種方式抑制腸道致病菌黏附到 HT-29

5、細(xì)胞上，其中L. paracasei M7的抑制效果最好，對(duì)三種致病菌的競(jìng)爭(zhēng)性抑制黏附抑制率分別為93%、83%和87%。研究結(jié)果顯示乳桿菌在抑制致病菌黏附的過(guò)程中表面層蛋白（S-層蛋白）發(fā)揮著重要作用，用5 mol/L LiCl處理乳桿菌菌體后乳桿菌抑制致病菌黏附的效果明顯降低，而L. paracasei M7對(duì)致病菌黏附的抑制率則降為49%、55%和73%(P<0.05）。根據(jù)SDS-PAGE分析，提取的S-層蛋白分子量為60 kD

6、a，其疏水性氨基酸的含量為43.2%。在鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵入細(xì)胞之前和之后，分別用 S-層蛋白處理鼠傷寒沙門(mén)氏菌均能夠降低致病菌的黏附效果。用流式細(xì)胞儀分析HT-29細(xì)胞的細(xì)胞周期，結(jié)果表明S-層蛋白能夠調(diào)控鼠傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)于細(xì)胞周期的影響，經(jīng)過(guò)S-層蛋白處理后細(xì)胞的S期占整個(gè)細(xì)胞周期的30.13%，而用鼠傷寒沙門(mén)氏菌單獨(dú)處理的細(xì)胞周期為26.88%。此外，S-層蛋白能夠抑制鼠傷寒沙門(mén)氏菌引起的細(xì)胞凋亡酶活性的提高，經(jīng)過(guò) S-層蛋白處理的

7、細(xì)胞和單獨(dú)用鼠傷寒沙門(mén)氏菌處理相比細(xì)胞凋亡酶活性顯著降低（P<0.05）。
　　研究了這5株乳酸菌的抑菌性能及其代謝產(chǎn)物對(duì)于鼠傷寒沙門(mén)氏菌細(xì)胞組成的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乳桿菌上清液能夠抑制鼠傷寒沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)，其中L. rhamnosus F0533抑制鼠傷寒沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)的效果最好，抑制率達(dá)到64%(P<0.05）。此外乳桿菌上清液還能夠殺死鼠傷寒沙門(mén)氏菌，經(jīng)過(guò)上清液混合處理2 h后鼠傷寒沙門(mén)氏菌的菌數(shù)降低了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。經(jīng)過(guò)上清液

8、處理的鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌體細(xì)胞內(nèi)的ATP酶含量受到顯著變化，與對(duì)照組相比乳桿菌L. rhamnosus F0533能夠使鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌體內(nèi)的ATP酶含量降低20%。通過(guò)傅里葉紅外分析經(jīng)過(guò)乳桿菌上清液處理的鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌體，發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌體細(xì)胞膜的脂肪酸和細(xì)胞壁上的多糖類物質(zhì)等都受到影響。
　　最后乳桿菌抑制鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵入腸道上皮細(xì)胞的機(jī)制進(jìn)行了研究。乳桿菌通過(guò)對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌破壞細(xì)胞上的緊密連接蛋白和細(xì)胞骨架的影響來(lái)抑

9、制鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵入細(xì)胞。研究結(jié)果顯示乳桿菌能夠阻止因?yàn)槭髠抽T(mén)氏菌破壞而導(dǎo)致的細(xì)胞膜電位的降低（P<0.05），維持細(xì)胞膜電位穩(wěn)定。乳桿菌能夠保護(hù)細(xì)胞緊密連接蛋白和肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示乳桿菌對(duì)于細(xì)胞膜電位、細(xì)胞緊密連接蛋白和肌動(dòng)蛋白的保護(hù)，預(yù)防的效果要強(qiáng)于修復(fù)作用。乳桿菌能夠增加上皮細(xì)胞上的表皮生長(zhǎng)因子的含量，比鼠傷寒沙門(mén)氏菌破壞的細(xì)胞含量提高40%左右。表皮生長(zhǎng)因子的增加使細(xì)胞緊密連接蛋白和細(xì)胞骨架蛋白mRNA的表達(dá)增加了30