生產(chǎn)GABA乳酸菌的篩選及其相關特性研究.pdf

1、乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)通常是指能夠利用可溶性碳水化合物產(chǎn)生乳酸的一類革蘭氏陽性菌的通稱。長期以來，乳酸菌被認為是安全(GenerallyRecongnized as Safe，GRAS)菌株，應用于食品發(fā)酵，改善產(chǎn)品的質(zhì)構與風味。目前，酸奶中應用較為廣泛的菌株有德氏乳桿菌及嗜熱鏈球菌。其中，嗜熱鏈球菌還與其它乳酸菌共同發(fā)酵生產(chǎn)硬質(zhì)奶酪等。
　　γ--氨基丁酸（γ-aminobutyric aci

2、d，GABA）是天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，2009年衛(wèi)生部正式批準過了GABA作為新資源食品，被廣泛的應用于食品加工業(yè)。GABA還是一種抑制性的神經(jīng)遞質(zhì)，對人體有很多積極的生理作用，如降血壓，緩解緊張，促進睡眠及治療癲癇等。谷氨酸脫羧酶是合成γ-氨基丁酸的關鍵酶，在眾多生物體中存在。由于乳酸菌的安全性，通過乳酸菌生產(chǎn)GABA具有良好的前景。本文對產(chǎn)生GABA的乳酸菌進行了篩選并對生產(chǎn)GABA的關鍵酶谷氨酸脫羧酶進行了克隆和異源表達，獲得

3、了富含GABA的乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品，具體工作和取得成果如下:
　　1、生產(chǎn)GABA乳酸菌的篩選
　　利川紙層析法對實驗室保藏的14株乳桿菌、1株嗜熱鏈球菌和2株乳酸乳球菌產(chǎn)生GABA能力進行初篩，結果表明嗜熱鏈球菌、副干酪乳桿菌及德式乳桿菌保加利亞亞種均能夠產(chǎn)生GABA;利用粗酶液測定谷氨酸脫羧酶(glutamatedecarboxylase，GAD)酶活進行復篩，發(fā)現(xiàn)這3株菌中嗜熱鏈球菌酶活最高。接著又對實驗室保存的28株嗜熱

4、鏈球菌產(chǎn)生GABA進行檢測，發(fā)現(xiàn)除Streptococcusthermphilus SDMCC050200外，其他27株均能產(chǎn)生GABA，其中SthermphilusSDMCC050201產(chǎn)量最高。利用PCR方法，對合成GABA的關鍵酶谷氨酸脫羧酶的基因gadB進行檢測，發(fā)現(xiàn)28株菌中均編碼有谷氨酸脫羧酶基因gadB。測序及序列比對發(fā)現(xiàn)，不產(chǎn)生GABA的菌株SDMCC050200其谷氨酸脫羧酶在171位殘基發(fā)生廠突變，山天冬氨酸突變?yōu)楦?/p>

5、氨酸。
　　2、谷氨酸脫羧酶的酶學性質(zhì)
　　分別克隆S thermphilus SDMCC050201和SDMCC050200的gadB在Escherichia coli中表達，表達蛋白經(jīng)Ni+柱純化，結果發(fā)現(xiàn)，表達的2種蛋白分子量大小相同，但是自來于SDMCC050200異源蛋白沒有酶活。本章對來自于S thermphilus SDMCC050201的GAD酶學性質(zhì)進行了研究，該酶大小為45kDa左右，與理論預測的分子量大

6、小一致。最適溫度為40℃，最適pH為4.0。在低pH，且低于50℃時保存酶，可以保持酶的較高活性。Ag+，Cu2+，SDS對酶的活性影響較大，在低濃度時能抑制酶的活性，而Ba2+、Co2+等能夠促進酶的活力。酶反應常數(shù)Km為11.27mmol·L-1、Vmax為16.64mmol·L-1·h-1。
　　3、谷氨酸脫羧酶的功能分析
　　利用同源雙交換對S.thermphilus SDMCC050201的gadB基因進行了敲除并

7、測序分析。結果發(fā)現(xiàn)，在gadB基因的上游與報道的Sthermphilus ND03不同，重新設計同源臂進行敲除，得到的敲除突變株株除gadB結構基因外，在其上游多敲掉200bp左右，由于gadB上游發(fā)現(xiàn)多敲除的部分高度疑似為gadB啟動子，因此以得到的該敲除株進行后續(xù)工作。與野生株株相比，突變株生長更有優(yōu)勢，表現(xiàn)在生長速度快，穩(wěn)定期的生物量高，且外源添加MSG(Sodium glutamatehydrate，MSG)時，菌株生長更好，表

8、明菌株生長與gadB無關。在酸脅迫條件下，我們發(fā)現(xiàn)在外源添加MSG時，野生株存活率增加，當pH=3時，gadB能夠賦予菌株抗酸脅迫能力;而pH=4時，gadB對菌株的保護能力不明顯。
　　4、GABA產(chǎn)生條件的優(yōu)化
　　利用高壓液相色譜法(HPLC)對GABA進行定量檢測，由于GABA本身沒有發(fā)光基團，采用丹磺酰氯衍生的方法，對樣品進行前處理，結果得到標準品數(shù)據(jù)具有很好的線性關系。對于在GMRS培養(yǎng)基中的發(fā)酵液進行檢測，結果

9、SDMCC050201得到GABA的含量為4.697+0.183 g/L;當替換GMRS碳源為乳糖時，GABA的產(chǎn)量為2.937±0.079g/L;當替換GMRS碳源碳源為蔗糖時，GABA的產(chǎn)量較高4.379+0.008g/L。將Sthermphilus SDMCC050201單獨接入滅菌牛奶或S thermphilus SDMCC050201與Lb.delbrueckii subsp.burgaricus ATCC11842共同接入滅