博爾納病病毒分子流行病學(xué)研究——樣本采集 病毒檢測 種系發(fā)生分析 細胞模型建立 試劑盒評價.pdf

1、
　　 WHO公布2003年席卷全球的SARS爆發(fā)流行，涉及32個國家和地區(qū)，全球累計病例8422例，死亡人數(shù)919人，病死率約11％。2004年禽流感病毒甲型H5N1在南亞和東南亞爆發(fā)流行，致使超過1億只家禽被捕殺，并傳播人類導(dǎo)致感染患者的死亡。2009年4月自墨西哥出現(xiàn)的第一例甲型H1N1流感病毒感染患者至2010年3月，該病毒的大流行已蔓延全球213個國家和地區(qū)。2010年4月，WHO公布迄今為止甲型H1N1病毒大流行已造

2、成17000余人死亡。截至2010年3月31日，中國31個省累計報告甲型H1N1流感確診病例120000例，死亡病例超過800例。近7年新發(fā)感染性疾?。╡merging infectiousdisease，EID）事件觸目驚心，對人類健康、經(jīng)濟發(fā)展和社會穩(wěn)定產(chǎn)生了巨大的影響，使人們對EID積極防控和健全相關(guān)公共衛(wèi)生安全體系產(chǎn)生了許多新的認識，并對EID病原體給予了高度關(guān)注。
　　 目的：
　　 本研究通過BDV分子流行病

3、學(xué)調(diào)查和研究，建立中國西北伊犁地區(qū)新發(fā)病毒BDV感染動物樣本庫，獲得BDV流行病學(xué)資料，了解不同種屬動物BDV流行現(xiàn)狀，分析BDV可能的種系來源，為制定預(yù)防和控制BDV爆發(fā)流行預(yù)案提供可靠依據(jù)，為健全公共衛(wèi)生安全體系奠定堅實的基礎(chǔ)。同時，建立BDV p40-OL細胞模型，為BDV發(fā)病機制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供平臺；進一步評價BDV熒光定量PCR診斷試劑盒，為BDV流行病學(xué)調(diào)查和臨床研究提供可靠的檢測手段。
　　 方法：
　　

4、 1.根據(jù)BDV感染宿主地源特殊性和種屬多樣性，選擇中國西北新疆伊犁地區(qū)作為樣本采集地點；伊犁馬、新疆驢、新疆雙峰駝、天山馬鹿和不同品種犬作為樣本采集動物；外周血和腦組織作為樣本采集對象。
　　 2.采用FQ-nRT-PCR方法，檢測8個品種150例犬PBMCs BDVp24 RNA基因片段。用檢測BDV p40 RNA片段和質(zhì)粒pMD19 BDVH1766 p24標準品驗證樣本BDV p24陽性產(chǎn)物，排除可能出現(xiàn)的假陽性。驗

5、證后的陽性產(chǎn)物進行基因測序、核苷酸和氨基酸序列同源比對以及系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析。
　　 3.在5個種屬8個品種873例動物PBMCs中，對伊犁馬、新疆驢和哈薩克牧羊犬共檢出的19例BDV p24 RNA陽性片段，進行BDV標準株He/80、strain V和H1766比對，分析核苷酸和氨基酸同源相似度，重構(gòu)基因系統(tǒng)發(fā)生樹，分析BDV可能的種系來源。
　　 4.培養(yǎng)人OL細胞株細胞，用含有BDV p40基因的質(zhì)粒pEGFP.N1

6、-BDV p40，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染OL細胞。通過G418篩選已轉(zhuǎn)染的0L細胞，獲得BDV p40蛋白穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)染態(tài)OL細胞。RT-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒BDV p40基因表達；觀察GFP表達、測定IHC和ELISA，鑒定BDV p40蛋白表達。最后，建立穩(wěn)定表達BDV p40的轉(zhuǎn)染態(tài)OL細胞模型。
　　 5.試劑盒評價在熱穩(wěn)定性評價方面，將BDV p24熒光定量PCR診斷試劑盒中試劑分裝多份一次PCR擴增反應(yīng)量。隨機取

7、出其中2份分別置于25℃和37℃兩種溫度的恒溫水浴箱內(nèi)進行熱處理。處理時間分別選擇3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h和96 h共7個時間段。在相應(yīng)溫度和熱處理時間完成后，對6個濃度梯度的質(zhì)粒pMD19 BDVH1766 p24標準品進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。通過對PCR反應(yīng)的CT值和R2值比較，評價試劑盒的熱穩(wěn)定性。在BDV檢測信度評價方面，選擇定量BDV（+）OL細胞和質(zhì)粒pMD19BDV H17

8、66 p24標準品，進行BDV p24基因片段PCR擴增。通過比較兩種檢測對象檢出BDV p24濃度梯度的一致性，評價試劑盒病毒檢測結(jié)果信度。
　　 結(jié)果：
　　 1.在樣本采集方面，伊犁地區(qū)樣本采集動物歸屬于5個種屬8個品種。種屬包括伊犁馬、新疆驢、新疆雙峰駝、天山馬鹿和犬；品種有哈薩克牧羊犬、德國牧羊犬、卡羅來納犬、西伯利亞雪橇犬、波音達獵犬、比格獵犬、德國杜賓犬和斗牛梗犬。樣本采集動物數(shù)量合計897例，其中伊犁馬5

9、82例，新疆驢204例，新疆雙峰駝4例，天山馬鹿1例，哈薩克牧羊犬95例，德國牧羊犬28例，卡羅來納犬14例，西伯利亞雪橇犬8例，波音達獵犬6例，比格獵犬4例，德國杜賓犬3例，斗牛梗犬2例。樣本采集對象為外周血、腦組織和全腦。采集樣本的數(shù)量為外周血樣本897份、腦組織樣本1573份和全腦樣本43份。
　　 2.在病毒檢測方面，在8個品種150例犬中，僅哈薩克牧羊犬檢出BDV p24片段，陽性率為11.0％（10/91）?；蛐蛄?/p>

10、與德國馬BDVHe/80和德國綿羊：BDV S6病毒株同源相似度分別為99.2％和95.7％，氨基酸相似度為100％和89.3％。親緣關(guān)系與He/80最近，其次為S6。
　　 3.在種系發(fā)生學(xué)方面，19例BDV p24核苷酸序列一部分形成伊犁獨立支系，其余部分匯聚至伊犁-德國-瑞士混合支系。獨立支系與標準病毒株無聚合，核苷酸序列同源相似度為98％，氨基酸序列為100％；德國馬He/80匯聚混合支系，核苷酸與氨基酸序列與He/80

11、同源相似度均為100％。
　　 4.在細胞模型建立方面，用RT-PCR擴增經(jīng)pEGFP-N1-BDV p40轉(zhuǎn)染的OL細胞中BDV p40基因核苷酸序列片段，擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳154 bp處出現(xiàn)一條清晰的條帶，其大小與目的片段一致。倒置熒光顯微鏡觀察，OL細胞核GFP表達量明顯大于細胞質(zhì)（細胞核/細胞質(zhì)=2.43），證明了BDV p40蛋白核定位的生物學(xué)特點。用BDV多克隆抗體和CIC單克隆抗體檢測pEGFP-N1-BDV

12、 p40、pEGFP-N1和正常OL細胞中BDV p40蛋白表達，結(jié)果顯示，前者均為陰性，后者均為弱陽性，三者之間無差異。
　　 5.在試劑盒評價方面，試劑盒熱穩(wěn)定評價顯示，經(jīng)25℃和37℃熱處理后，各溫度7個不同時間段BDV p24 PCR.反應(yīng)CT值之間無差異，保持正常PCR擴增效率的熱處理持續(xù)時間范圍為3 h～96 h；25℃和37℃兩種溫度條件下不同時間段平均尺2值之間亦無差異。BDV檢測信度評價方面顯示，在定量BDV（

13、+）OL細胞（12個濃度梯度即100～10-11）和質(zhì)粒pMD19 BDV H1766 p24標準品（6個濃度梯度即100～10-5）中，均可檢測4個濃度梯度即100、10-1、10-2和10-3，最低檢測濃度為10-3。
　　 結(jié)論：
　　 1.伊犁地區(qū)所采集不同種屬和品種的動物血液和腦組織樣本量，可基本反映該地區(qū)BDV自然感染現(xiàn)狀，納入動物性別和年齡的同質(zhì)性進一步提高了調(diào)查結(jié)果的可靠性。在國內(nèi)外首次建立了馬科動物快速

14、開顱全腦采集的新方法。
　　 2.伊犁地區(qū)可能存在BDV自然感染，哈薩克牧羊犬為BDV貯存宿主，其自然感染陽性率為11.0％；該地區(qū)BDV流行病毒株可能與伊犁馬BDV He/80的交叉感染和引進德國Saxony美利奴綿羊BDV S6病毒株的輸入感染有關(guān)。
　　 3.首次提出了新疆伊犁河谷動物宿主中可能存在地源性BDV獨立種系，形成哈薩克牧羊犬BDV KT078和KT079病毒株；同一種系BDV株在伊犁河谷不同種屬動物間的

15、感染，可能源于外來疫病病原體經(jīng)草原絲綢之路的傳播。
　　 4.質(zhì)粒pEGFP-N1-BDV p40轉(zhuǎn)染人OL細胞后BDV p40基因和蛋白在細胞內(nèi)的穩(wěn)定表達，建立了轉(zhuǎn)染態(tài)BDV p40-OL細胞模型，為探索BDV p40單一病毒蛋白在宿主中的作用和：BDV致抑郁癥發(fā)病機制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了有效的手段。
　　 5.熒光定量BDV p24診斷試劑盒在一定范圍內(nèi)不受溫度（25℃/37℃）和在該溫度下持續(xù)使用時間（3 h～9