博爾納病病毒多種檢測(cè)方法的比較和細(xì)胞水平研究.pdf

1、背景和目的：
　　 新發(fā)病毒感染疾病是本世紀(jì)對(duì)人類公共衛(wèi)生的新挑戰(zhàn)，面對(duì)突如其來(lái)的大規(guī)模爆發(fā)性新發(fā)病毒感染，我們經(jīng)常束手無(wú)策。如果能夠在已知的有可能爆發(fā)感染的病毒中預(yù)先了解病毒的感染機(jī)制、預(yù)測(cè)其爆發(fā)的可能性、構(gòu)建可靠而有效的病毒檢測(cè)體系以及治療措施，這些疾病是可以被預(yù)防和控制的。
　　 博爾納病病毒（Borna Disease Virus，BDV）屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的新發(fā)病毒。一百多年前首次在德國(guó)發(fā)現(xiàn)時(shí)，BDV曾經(jīng)導(dǎo)致

2、大量馬匹發(fā)生爆發(fā)性腦炎而死亡，因而被認(rèn)為是烈性病毒。人類中發(fā)現(xiàn)的BDV感染病例，引起的是慢性的潛伏感染和精神行為異常。由于BDV有在動(dòng)物中爆發(fā)的先例，不能排除其通過(guò)自然變異引起人群爆發(fā)感染的可能。更值得關(guān)注的是，今年初Nature報(bào)道，BDV的核蛋白基因已經(jīng)部分整合到人類和部分動(dòng)物的基因組內(nèi)，該病毒與人類多種疾病的發(fā)病有關(guān)。建立完善的檢測(cè)體系是研究BDV關(guān)鍵的第一步，所以在驗(yàn)證和比較BDV的各種檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，構(gòu)建不同需要下BDV檢測(cè)

3、方法的組合預(yù)案以及運(yùn)用這些檢測(cè)方法研究BDV的感染機(jī)制意義重大。
　　 方法:
　　 1.將課題組新建立的BDV P40（Neucleoprotein）實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法與早期建立的BDV P24（Phosphoprotein）實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法用持續(xù)感染的BDV細(xì)胞株進(jìn)行敏感性、特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性的評(píng)估和實(shí)際應(yīng)用。
　　 2.構(gòu)建BDV磷蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞模型，建立BDV的原位PCR檢測(cè)方法，與抗體檢測(cè)

4、方法比較，并在實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的樣本上進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用。
　　 3.應(yīng)用ELISA法檢測(cè)樣本的循環(huán)免疫復(fù)合物（Circulating immunecomplexes，CIC），并與實(shí)時(shí)熒光PCR、抗體檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。
　　 4.比較以上各種方法的特點(diǎn)，建立適合于不同需要的BDV檢測(cè)組合預(yù)案。
　　 5.使用原位PCR、ELISA和熒光顯微鏡在構(gòu)建的BDV磷蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞模型上觀察BDV P24轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在轉(zhuǎn)

5、染后各個(gè)時(shí)期核酸和蛋白的亞細(xì)胞定位和表達(dá)量。使用MTT檢測(cè)磷蛋白轉(zhuǎn)染對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞株（Oligodendrocyte，OL）的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.兩種檢測(cè)方法敏感性、特異性均好，不同批次試劑的檢測(cè)結(jié)果差異較小，加速破壞實(shí)驗(yàn)顯示試劑對(duì)溫度的耐受性好。在兩種檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用中對(duì)臨床病人檢測(cè)陽(yáng)性率為3.6％（7/198，P24和P40檢測(cè)方法），對(duì)動(dòng)物檢測(cè)陽(yáng)性率為豬4.4％（16/360，P24檢測(cè)方法）和4.2

6、％（15/360，P40檢測(cè)方法），馬1.7％（9/527，P24檢測(cè)方法）和1.5％（8/527，P40檢測(cè)方法）。該檢測(cè)方法可以作為BDV大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室研究的可靠工具。
　　 2.在OL細(xì)胞磷蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞模型上，建立并驗(yàn)證了原位PCR檢測(cè)BDV的方法，并在實(shí)時(shí)熒光PCR檢出陽(yáng)性的病例的外周血淋巴細(xì)胞上進(jìn)行了實(shí)際應(yīng)用。
　　 3.使用ELISA（針對(duì)CIC）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BDV陽(yáng)性率為36％，高于RNA檢測(cè)和抗

7、體檢測(cè)的陽(yáng)性率。提示我國(guó)BDV以攜帶形式感染的人群遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出顯性的感染人群。
　　 4.通過(guò)對(duì)以上各種方法的綜合比較，建立了針對(duì)流行病學(xué)調(diào)查、臨床診斷和感染機(jī)制研究的聯(lián)合檢測(cè)預(yù)案。
　　 5.BDV轉(zhuǎn)染的早期磷蛋白主要分布在細(xì)胞核，而后期則分布于整個(gè)細(xì)胞；磷蛋白的核酸始終分布在細(xì)胞核內(nèi)；MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BDV磷蛋白對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用。
　　 結(jié)論:
　　 通過(guò)比較BDV的實(shí)時(shí)熒光PCR、原位PC