蝙蝠攜帶冠狀病毒的分子流行病學研究.pdf

1、研究背景和目的: SARS爆發(fā)后，蝙蝠作為多種人獸共患病病毒的自然宿主越來越引起人們的重視。 1.蝙蝠種類多，分布廣 蝙蝠隸屬翼手目(Chiroptera)，是哺乳類中分布最廣、數量最多的動物之一，全世界大約有17科180屬，約960種，其中我國有7科29屬107種。翼手目分兩個亞目：大蝙蝠亞目(Megachiroptera)，又稱狐蝠，我國有1科5屬7種；小蝙蝠亞目(Microchiroptera)，即通常所說

2、的蝙蝠，我國有6科24屬100種。 除南北極外，蝙蝠在世界各地都有分布，包括在高緯度地區(qū)、荒涼的沙漠和孤立的島嶼上，甚至在撒哈拉大沙漠也有蝙蝠的活動。然而，大多數蝙蝠種類生活在熱帶和亞熱帶地區(qū)。蝙蝠物種豐富，分布廣泛，壽命長，并有很強的飛行能力，其中一些蝙蝠種類還有長途遷移的習性。 蝙蝠與人類接觸密切。有些蝙蝠就棲息在屋檐下，或是房屋的裂縫中；另外蝙蝠在覓食時經常會誤闖入居民家中；一些旅游景點的巖洞中也居住有蝙蝠。在中醫(yī)

3、里面，菊頭蝠的糞便被做成“夜明沙”用于治療眼疾：在廣東，果蝠被一些餐館作為野味擺上餐桌；湖南一些地區(qū)則相信蝙蝠可以用來治療癲癇。 2.蝙蝠與冠狀病毒 2002～2003年爆發(fā)的SARS，在確定SARS冠狀病毒(SARS-CoV)的動物源性后，香港大學微生物系和中科院的研究人員分別發(fā)表文章宣布從菊頭蝠科的蝙蝠中檢測出蝙蝠SARS樣冠狀病毒(Bat-SARSCoV)，與人SARS冠狀病毒的核苷酸同源性>88％，并且從菊頭蝠科

4、的成員中檢出很高的抗體陽性率。因此，研究人員將冠狀病毒的自然宿主鎖定在蝙蝠上，并對野生蝙蝠展開了一系列的研究，結果發(fā)現，蝙蝠所攜帶的冠狀病毒基因多樣性極其豐富，迄今為止已經從蝙蝠中發(fā)現了十幾種新的冠狀病毒。但是通過對冠狀病毒與宿主受體結合的S蛋白基因編碼區(qū)的同源性分析表明，bat-SARSCoV與SARS-CoVS基因的同源性僅為64％，因此，SARS-CoV的直接祖先還未被發(fā)現，其從感染動物宿主到感染人宿主的進化歷程還沒有完全搞清楚，

5、對已發(fā)現的冠狀病毒進行的系統(tǒng)進化分析也表明還有更多新的冠狀病毒沒有被發(fā)現，現在已知的可能只是自然界中的冠狀病毒一個很小的子集。 鑒于蝙蝠攜帶冠狀病毒基因型多態(tài)性豐富，以及蝙蝠的生態(tài)學特性，期望從中發(fā)現其他與SARS-CoV更為同源的冠狀病毒，描繪出病毒在自然宿主中的詳細進化歷程，有助于預防和控制SARS的再次爆發(fā)流行。因此，我們從海南、廣東和湖南省部分地區(qū)收集蝙蝠標本，利用免疫學和分子生物學檢測技術對蝙蝠攜帶冠狀病毒進行一次初步

6、的分子流行病學調查。 研究方法: 1.蝙蝠標本的收集和處理 2007年5月至8月之間，在海南、廣東和湖南省部分地區(qū)共收集蝙蝠468只。進行編號后，請廣州大學生命科學院蝙蝠研究專家吳毅教授進行鑒定。采集蝙蝠的地方主要有廢棄的房屋，或者房屋的縫隙、屋檐，以及野外陰濕的山洞。 ①血清的采集。主要用兩種方法，后肢靜脈采血和心臟采血。采集的血樣4℃靜置5h后，3000r/min離心10min，取上清，裝在EP管中，

7、編號，4℃運送回實驗室，立即檢測。 ②直腸樣本的處理。通過無菌操作解剖蝙蝠，取肛門上端直腸組織標本約2～3cm，保存在含有RNAlater的凍存管中，4℃運輸，回實驗室后，立即檢測或放入-70℃保存。 2.蝙蝠血清冠狀病毒抗體的SPA-ELISA檢測 ①利用葡萄球菌A蛋白(StaphylococcusproteinA，SPA)能夠天然地與人及某些哺乳動物的IgG分子上的Fc片段結合的特性，建立了一種新的SPA-E

8、LISA方法，用于檢測蝙蝠血清冠狀病毒抗體： ②利用建立的SPA-ELISA對海南、廣東和湖南部分地區(qū)收集的蝙蝠血清進行檢測。 3.蝙蝠腸道冠狀病毒的RT-PCR檢測 ①參考文獻，以及對已知的冠狀病毒序列進行比對，找到冠狀病毒的保守序列設計引物。引物擴增的目的基因位于RNA依賴的RNA多聚酶編碼區(qū)，能夠擴增已知的大部分冠狀病毒，包括蝙蝠冠狀病毒； ②利用RT-PCR檢測蝙蝠直腸樣本中的冠狀病毒。

9、4.測序和基因分析 ①對于擴增獲得的目的基因進行測序； ②測序結果利用GeneBank的BLAST軟件進行在線同源性分析； ③在GeneBank下載其他冠狀病毒序列，利用ClustalW進行多序列比對分析； ④用MEGA4.0軟件，采用Neighbor-Joining法，Jukes-Cantor模型做進化樹分析。 5.質量控制 ①槍頭、EP管、凍存管、手套等實驗耗材均為一次性用品；

10、 ②逆轉錄過程采用的槍頭、EP管和研磨器用DEPC處理，高溫高壓消毒，烤干后待用，以去除RNA酶污染： ③RNA的提取，RT-PCR的反應體系的試劑加樣均在無菌間生物安全II級超凈臺進行操作，防止環(huán)境中RNA酶的污染； ④操作過程中，全程戴口罩、帽子，勤換手套，防止樣本和試劑受到來自操作者攜帶的RNA酶污染； ⑤在RNA提取，RT-PCR，SPA-ELISA過程中均設立陽性對照和陰性對照。 三、研究結果:

11、 1.蝙蝠的基本情況 本次研究在海南、廣東和湖南3個省共收集蝙蝠468只，包括4個科，12個種。共收集血清樣本274份，直腸樣本468份。 2.蝙蝠血清冠狀病毒抗體的檢測情況 ①建立的SPA-ELISA檢測方法快速、簡便，檢出濃度低，即使在野外的條件下也可以通過顏色的變化來簡單判定結果；而且需要的血清量小，完全可以在不傷害動物的情況下完成檢測； ②利用SPA-ELISA從采集的274份血清樣本中檢

12、測出36份陽性，陽性率為13.14％(36/274)。冠狀病毒抗體檢出自4種蝙蝠，分別為普通長翼蝠20.45％(27/132)，中華菊頭蝠11.11％(2/18)，中菊頭蝠9.26％(5/54)，棕果蝠3.64％(2/55)。 3.蝙蝠腸道冠狀病毒的檢測情況 利用RT-PCR，從13份蝙蝠直腸樣本中擴增獲得目的基因片段，總陽性率為2.78％(13/468)。13份樣本全部來自湖南省，包括2個科的4種蝙蝠。其中4份樣本檢出

13、自普通長翼蝠，陽性率2.63％(4/152)；6份樣本檢出自中菊頭蝠，陽性率3.85％(6/156)：2份樣本檢出自中華菊頭蝠，陽性率6.90％(2/29)：1份樣本來自小菊頭蝠，陽性率16.67％(1/6)。 4.測序和基因分析結果 ①BLAST同源性比對結果，從普通長翼蝠檢出2種冠狀病毒bat-CoVHKU7與bat-CoV1A：從中菊頭蝠和中華菊頭蝠中都檢測出2種冠狀病毒，bat-CoVHKU2與bat-SARS-

14、CoV：從小菊頭蝠中檢出bat-SARS-CoV： ②用軟件ClustalW進行多序列比對分析和MAGA4.0構建進化樹表明冠狀病毒的基因多態(tài)性豐富，3種屬于冠狀病毒group1，1種屬于group2。 結論: ①建立了的蝙蝠血清冠狀病毒抗體SPA-ELISA檢測方法： ②湖南地區(qū)的蝙蝠可攜帶冠狀病毒，血清冠狀病毒抗體陽性率為13.14％(36/274)，直腸冠狀病毒陽性率2.78％(13/468)：