犬冠狀病毒的流行病學(xué)調(diào)查及地方株的特性研究.pdf

1、　　1.收集犬糞樣138份，用可鑒定基因型的套式PCR方法檢測犬冠狀病毒(CCV)。結(jié)果表明，所得Ⅱ型CCV序列都與CCV1-71及來自中國大熊貓CCV的M基因序列有很高的同源性，與豬傳染性胃腸炎冠狀病毒(TGEV)的同源性高于Ⅰ型貓冠狀病毒(FcoV)代表株UCD1和Ⅱ型FCoV代表株FIPV79-1683。一個(gè)來自昆明的CCV序列在系統(tǒng)進(jìn)化樹上處于Ⅰ和Ⅱ型CCV之間，可能是一個(gè)新的變異株?！　?.用A72細(xì)胞從RT-nPCR檢測陽

2、性的腹瀉犬糞樣中分離CCV，經(jīng)RT-nPCR和免疫熒光試驗(yàn)鑒定，成功分離到4株CCV野毒，分別命名為CCVKM、NJ2、NJ17、SH3。對(duì)CCVKM毒株進(jìn)行了電鏡觀察，可見到與CCV參考毒株1-71相似的帶“冠”的病毒粒子?！　?.蝕斑克隆純化CCV1-71株，然后經(jīng)蔗糖密度梯度離心提純抗原，免疫BALB/C小鼠，小鼠脾臟與SP2/0細(xì)胞融合，用ELISA方法篩選到一株ELISA效價(jià)高的雜交瘤細(xì)胞株E1，用中和試驗(yàn)方法篩選到兩株有中

3、和抗體作用的雜交瘤細(xì)胞株N1、N2?！　?.用抗CCV1-71的單抗展示了CCV毒株在A72細(xì)胞的釋放方式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCV毒株在A72的一極釋放，細(xì)胞免疫熒光染色呈極端著色現(xiàn)象。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)單抗N1、N2與KM作用后感染細(xì)胞，CPE產(chǎn)生的時(shí)間提前，子代病毒效價(jià)升高?！　?.對(duì)CCV參考株1-71，Tn449及來自腹瀉犬糞樣的南京株NJ17株的M基因進(jìn)行了克隆、測序，并與GenBanK中所有已知CCV及同亞群的TGEV和FcoV代表

4、株的M基因進(jìn)行了同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析，同時(shí)對(duì)M蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了預(yù)測分析?！　?.對(duì)CCV1-71S基因和南京分離株NJ17的部分S基因進(jìn)行了克隆、測序，得到的序列與GenBanK中所有已知CCV及同亞群的TGEV和FCoV代表株的S基因進(jìn)行同源性比較和同源重組分析，同時(shí)對(duì)S蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了預(yù)測分析。　　7.分段克隆了CCV1-71的S基因，并借助中間載體連接得到CCV1-71S基因457-4362bp、542-436