新型化合物—甲胺鳶尾素對(duì)急性心肌缺血損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究目的： 急性心肌缺血性損傷（Acute Myocardial Ischemia，AMI）是嚴(yán)重危害我國(guó)中老年人健康的重大疾病，也是最常見(jiàn)的猝死原因之一。心肌缺血后的修復(fù)過(guò)程及預(yù)后與缺血心肌血管的功能狀態(tài)密切相關(guān)，缺血區(qū)內(nèi)是否有血管迅速生成對(duì)于心肌缺血后建立良好的側(cè)支循環(huán)、改善缺血區(qū)血液供應(yīng)、促進(jìn)缺血區(qū)心肌的存活具有非常重要的意義。介入治療如經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)（PTCA）和冠狀動(dòng)脈內(nèi)支架是目前AMI后血運(yùn)重建的常用方法，但

2、由于介入治療只適于直徑>2mm的動(dòng)脈，對(duì)直徑<2 mm的動(dòng)脈和具體負(fù)責(zé)灌注的微小血管則無(wú)能為力，且存在術(shù)后再狹窄（25％～50％）問(wèn)題，以至有相當(dāng)多的病人（20％～37％）不能達(dá)到完全血運(yùn)重建而影響預(yù)后。除了殘存血管的重新開(kāi)放，近年來(lái)，誘導(dǎo)血管新生以重建血運(yùn)挽救瀕死的心肌成為治療AMI所致心肌損傷的一個(gè)新策略，這種方法又被稱(chēng)為“治療性血管新生”。雖然目前對(duì)血管新生及治療性血管新生進(jìn)行了較多的基礎(chǔ)及臨床方面的研究，各種血管生長(zhǎng)因子及轉(zhuǎn)基因

3、治療的促進(jìn)血管新生作用己被認(rèn)可，但由于多種血管生長(zhǎng)因子本身的局限性和應(yīng)用的煩瑣及轉(zhuǎn)基因治療中尚存在許多問(wèn)題使其在臨床上的應(yīng)用受到限制，所以需要尋找以誘導(dǎo)血管新生為靶點(diǎn)的更方便、有效、實(shí)用的藥物來(lái)代替生長(zhǎng)因子。 我們前期的研究結(jié)果表明，從葛花中提取分離的異黃酮化合物葛花苷具有明顯的耐缺氧活性和抗心肌缺血活性，亦具有明顯的改善血液粘度活性及抗血栓形成作用，但是該化合物水溶性較差，使其研究受到一定的限制。因此，我們對(duì)葛花苷結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾

4、，在保留活性基團(tuán)的基礎(chǔ)上，增加水溶性基團(tuán)，克服該化合物所存在的不足，得到一個(gè)新型化合物-甲胺鳶尾素。該化合物水溶性增加，易吸收。小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)表明，該新型化合物毒性較低。我們擬在此基礎(chǔ)上深入研究這一新型化合物對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用，從其對(duì)缺血心肌心功能、缺血缺氧/再灌注損傷、促血管新生信號(hào)通路因子（HIF-1α、VEGF、NO）等多方面深入研究其作用機(jī)制，為缺血性心臟病的治療提供新的藥物靶點(diǎn)和創(chuàng)新型藥物。 研究方

5、法： 本研究分為兩大部分。第一部分采用體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究甲胺鳶尾素對(duì)心肌缺血損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。第二部分采用體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究甲胺鳶尾素在急性心肌缺血損傷后促進(jìn)血管新生的的作用與機(jī)制。 第一部分：甲胺鳶尾素改善急性心肌缺血損傷的作用及機(jī)制研究 首先，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察了新型化合物甲胺鳶尾素對(duì)健康小鼠常壓耐缺氧存活時(shí)間、電刺激大鼠血栓形成時(shí)間及對(duì)正常大鼠血液粘度的影響，研究甲胺鳶尾素對(duì)動(dòng)物耗氧量及血液流變學(xué)的影響；分別采用異

6、丙腎上腺素多次皮下注射和經(jīng)典的冠狀動(dòng)脈結(jié)扎方法建立急性心肌缺血損傷模型，觀察甲胺鳶尾素對(duì)缺血心肌病理改變、缺血/梗塞面積、心肌酶、心功能、血漿CGRP和ET-1水平等的影響，探討其對(duì)心肌缺血損傷的保護(hù)作用。 其次，體外實(shí)驗(yàn)以原代培養(yǎng)的Wistar乳鼠心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，以高純氮?dú)猓?9％）飽和與否建立細(xì)胞缺血再灌注損傷（缺氧3h、再灌注6h）模型，以甲胺鳶尾素對(duì)損傷心肌細(xì)胞形態(tài)的變化及細(xì)胞存活率的影響、對(duì)損傷細(xì)胞超氧化物岐化酶（

7、SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、乳酸脫氫酶（LDH）的釋放量、活性氧生成量、線粒體膜電位、凋亡細(xì)胞比率及細(xì)胞內(nèi)鈣含量等為觀察指標(biāo)，從細(xì)胞水平上探討甲胺鳶尾素保護(hù)心肌細(xì)胞缺血損傷的作用機(jī)制。 第二部分：甲胺鳶尾素在急性心肌缺血損傷后促血管新生的作用與機(jī)制研究 采用結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈前降支方法造成急性心肌缺血損傷模型，觀察甲胺鳶尾素連續(xù)給藥30天對(duì)缺血心肌梗塞邊緣區(qū)血管新生的作用、對(duì)梗塞邊緣區(qū)心肌超微結(jié)構(gòu)的影響；分別采用免

8、疫組化、Western blot、實(shí)時(shí)定量PCR等方法定性、定量的觀察甲胺鳶尾素對(duì)缺血心肌缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）及其調(diào)節(jié)的下游靶基因血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）表達(dá)的影響；分別采用ELISA、放免、酶檢測(cè)法檢測(cè)甲胺鳶尾素對(duì)血清VEGF、血漿降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）和內(nèi)皮素（ET-1）水平、血清一氧化氮（NO）含量的影響；觀察甲胺鳶尾素對(duì)培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖、遷移和管

9、樣結(jié)構(gòu)形成以及缺氧損傷后NO含量的影響，明確甲胺鳶尾素在急性心肌缺血后促進(jìn)血管新生的作用與機(jī)制。 結(jié)果： 1.甲胺鳶尾素一次性腹腔注射給藥300mg/kg和150mg/kg均能明顯增加小鼠常壓下耐缺氧存活時(shí)間（P<0.01）；200、100mg/kg劑量可明顯降低大鼠血液粘度（P<0.01），延長(zhǎng)電刺激大鼠頸動(dòng)脈血栓形成時(shí)間（P<0.05）。 2.甲胺鳶尾素200、100mg/kg對(duì)異丙腎上腺素所致大鼠心肌缺血損

10、傷具有明顯的保護(hù)作用，能減輕異丙腎上腺素對(duì)心肌缺血的病理性損害，穩(wěn)定細(xì)胞膜，使心肌酶釋放減少，與對(duì)照組比較差異顯著（P<0.05）。 3.甲胺鳶尾素80mg/kg劑量組明顯減輕犬急性心肌缺血程度（∑-ST）、縮小缺血范圍（N-ST）、縮小心肌梗塞面積；40mg/kg劑量組有降低心肌缺血程度和縮小心肌梗塞范圍的趨勢(shì)，但與模型組比較無(wú)明顯差異（P>0.05）。甲胺鳶尾素80mg/kg劑量組給藥后2-4h使血清磷酸肌酸激酶同功酶（CK

11、-MB）、LDH釋放量明顯降低。40mg/kg劑量組給藥后4h顯著降低LDH釋放量（P<0.05），對(duì)血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、磷酸肌酸激酶（CK）有降低趨勢(shì)，但與模型組比較無(wú)明顯差異（P>0.05）。 4.甲胺鳶尾素200mg/kg劑量組可以明顯改善大鼠急性心肌梗塞后心肌病理改變；使心肌收縮壓、舒張壓、左室內(nèi)壓升高，心率減慢（P<0.01）；血漿CGRP和ET-1水平達(dá)到穩(wěn)態(tài)平衡。 5.甲胺鳶尾素（10-7 M，10-

12、6 M，10-5 M）能明顯提高缺血（3h）再灌注（6h）損傷細(xì)胞存活率，提高細(xì)胞內(nèi)SOD活性，明顯降低細(xì)胞內(nèi)MDA和ROS生成量、降低凋亡細(xì)胞比率，升高線粒體膜電位、明顯降低細(xì)胞內(nèi)鈣含量，與模型組比較差異顯著（P<0.01）。 6.甲胺鳶尾素使急性心肌缺血邊緣區(qū)心肌新生毛細(xì)血管密度增加；明顯改善缺血心肌的超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)論； 1.甲胺鳶尾素能明顯增加耐缺氧小鼠存活時(shí)間、延長(zhǎng)電刺激大鼠血栓形成時(shí)間、降低大鼠血液粘度

13、；減輕異丙腎上腺素對(duì)心肌的病理性損害、減少心肌酶的釋放；明顯減輕冠脈結(jié)扎犬心肌缺血/梗塞面積；明顯改善急性心肌梗塞后大鼠心功能，具有明顯的心肌缺血保護(hù)作用，其機(jī)制可能與改善受損心肌供血、供氧，穩(wěn)定細(xì)胞膜，從而調(diào)節(jié)能量代謝、改善血液流變作用有關(guān)。 2.甲胺鳶尾素可提高缺血再灌注損傷細(xì)胞存活率、提高氧自由基清除能力、降低細(xì)胞活性氧水平、升高線粒體膜電位。其機(jī)制可能與增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶活性、降低缺氧再給氧產(chǎn)生的活性氧水平，從而改善線粒體

14、功能、降低細(xì)胞內(nèi)鈣超載有關(guān)。 3.缺血缺氧損傷心肌HIF-1α基因表達(dá)未見(jiàn)明顯變化、蛋白表達(dá)增加，VEGF基因和蛋白表達(dá)均明顯增加，NOS活性增強(qiáng)、NO合成增加，說(shuō)明在我們的實(shí)驗(yàn)條件中缺血缺氧并不影響HIF-1α基因表達(dá)，但可減少其降解，增加其活性，啟動(dòng)HIF-1α-VEGF-NO信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，代償性起到心肌保護(hù)作用。但是隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，代償作用減弱。因此，維持HIF-1α-VEGF-NO信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)是治療缺血性心臟病的

15、靶點(diǎn)之一。 4.甲胺鳶尾素能明顯增加心肌缺血邊緣區(qū)微血管形成，可使HIF-1α、VEGF表達(dá)均維持在較高水平，血清VEGF、NO水平升高，說(shuō)明其可以促進(jìn)HIF-1α-VEGF-NO這一信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而改善缺血心肌微循環(huán)和氧的供需平衡，起到“藥物搭橋”治療心肌缺血的作用。 5.甲胺鳶尾素可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞增殖、遷移和管樣結(jié)構(gòu)形成，增加內(nèi)皮細(xì)胞NOS合成分泌NO的能力，這可能是其發(fā)揮改善微循環(huán)、增加缺血區(qū)血

16、供，從而產(chǎn)生“治療性血管新生”的機(jī)制之一。本研究的意義與創(chuàng)新點(diǎn)心肌缺血性損傷是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的重要疾病，研究防治此類(lèi)疾病的藥物并探討其機(jī)制具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。本研究明確了新型化合物甲胺鳶尾素對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用及其機(jī)制，為其防治缺血性心臟病的研究開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)： 1.對(duì)葛花苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，得到有良好藥理活性的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型化合物-甲胺鳶尾素，申報(bào)國(guó)家專(zhuān)利號(hào)：200610068403.5

17、。 2.對(duì)心肌缺血模型中血漿CGRP和ET-1水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，明確心肌缺血發(fā)生發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)；明確了促進(jìn)HIF-1α-VEGF-NO信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)是治療缺血性心臟病的靶點(diǎn)之一。 3.闡明了甲胺鳶尾素可以通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞膜、改善微循環(huán)、降低鈣超載、減輕線粒體損傷，促進(jìn)HIF-1α-VEGF-NO這一信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而提高促血管新生因子（HIF-1α、VEGF、eNOS）的表達(dá)，發(fā)揮心肌缺血的保護(hù)作用。 4.本課