大蒜辣素對心肌缺血大鼠的心肌保護作用及機制研究.pdf

1、心肌缺血是危害人類健康的主要疾病之一，由其導致的心肌梗死更是引起患者死亡的重要原因。心肌缺血可致氧自由基大量增加，氧化應激又可進一步加重心肌缺血性損傷;而心肌梗死后的心室重塑及纖維化更是導致心功能下降的主要病理基礎。心肌細胞肥大、炎癥和纖維化被認為是心肌梗死后組織進行代償修復最主要病理特征，這種特征又可導致心功能的進一步下降，從而引發(fā)惡性循環(huán)。因此，尋找安全有效的防治心肌缺血損傷及阻止缺血后心室重塑和纖維化的藥物具有重要意義。
　

2、　大蒜辣素是國際公認的大蒜主要活性物質(zhì)，國內(nèi)一直將大蒜素作為大蒜的主要活性成分，因此對大蒜辣素的研究較少。大蒜辣素是一種具有多種生物活性的藥物，許多研究證實其具有抑制細胞凋亡、抗炎、抗氧化等作用。本研究主要研究大蒜辣素對急性心肌缺血的即刻保護作用及長期應用對梗死后心室重塑和心肌纖維化的防治作用，在此基礎上進一步研究了大蒜辣素對心肌成纖維細胞功能及其電生理的影響，為大蒜辣素應用于臨床提供實驗依據(jù)。
　　目的:
　　1.明確大蒜

3、辣素對急性心肌缺血大鼠的心肌保護作用及對缺血后氧化應激的對抗作用。
　　2.研究大蒜辣素長期應用對大鼠心肌缺血后心室重塑和心功能的影響，并明確其對梗死后心肌纖維化的干預作用及其與TGFβ/Smads信號通路的關系。
　　3.闡明大蒜辣素對大鼠心肌成纖維細胞增殖分化及膠原分泌的的影響，并進一步明確大蒜辣素對心肌成纖維細胞中電導鈣激活鉀通道(KCa3.1)電流及通道的影響。
　　方法:
　　1.大蒜辣素對急性心肌梗死

4、大鼠的心肌保護作用
　　250只wistar大鼠隨機分為七組:空白對照組、假手術組、模型組、地爾硫革組(1.5mg/kg)、大蒜辣素低(1.2mg/kg)、中(1.8mg/kg)、高(3.6mg/kg)劑量組。除空白組和假手術組外，其余各組大鼠均采用冠狀動脈結扎方法復制大鼠心肌缺血模型，術后即刻尾靜脈注射相應藥物，24h后處死大鼠，取心臟及血清檢測以下指標:血清肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)、肌紅蛋白(Mb)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)

5、以及氧化應激指標SOD、MDA、CAT、GSH-Px水平;NBT染色檢測心肌梗死范圍。
　　2.大蒜辣素對大鼠心肌梗死后心室重塑和心肌纖維化防治作用
　　Wistar大鼠60只，隨機分為六組:假手術組、模型組、地爾硫革(1.5mg/kg)組和大蒜辣素低劑量組(1.2mg/kg)、中劑量組(1.8mg/kg)、高劑量組(3.6mg/kg)。除假手術組外，其余各組冠狀動脈結扎法復制大鼠心肌缺血模型，假手術組只穿線不結扎。模型制作

6、成功后第二天各組開始腹腔注射相應藥物，連續(xù)給藥21天。21天后，小動物超聲檢測大鼠心臟結構及功能的變化;Masson染色觀察心臟纖維組織變化;免疫組化檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原和TGFβ1/Smads信號途徑相關蛋白TGFβ1、Smad3和Smad7的表達表達情況。
　　3.大蒜辣素對大鼠心肌成纖維細胞的作用及機制
　　采用差速貼壁法體外分離培養(yǎng)乳鼠心肌成纖維細胞，將細胞分為正常對照組、AngⅡ組，大蒜辣素低（0.2μM）、中(1μM

7、)、高(5μM)劑量組。除正常對照組外，其余組利用AngⅡ誘導心肌成纖維細胞增殖分化，大蒜辣素各劑量組同時給予大蒜辣素干預。24h后檢測以下指標:倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)學變化;MTS檢測各組細胞增殖情況;免疫熒光染色檢測細胞內(nèi)α-SMA表達以確定其分化;qRT-PCR和Western blot檢測成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA及蛋白表達;膜片鉗技術記錄心肌成纖維細胞KCa3.1電流密度，并應用qRT-PCR和Westernblot

8、確定大蒜辣素對KCa3.1mRNA和蛋白表達的影響;在此基礎上利用H2S合成酶抑制劑PAG進一步確定H2S信號途徑與大蒜辣素作用的關系。
　　結果:
　　1.大蒜辣素對急性心肌梗死大鼠的心肌保護作用
　　(1)心肌梗死范圍和血清標志物
　　與模型組比較，地爾硫革及大蒜辣素低、中、高劑量均顯著降低心肌梗死大鼠模型的心肌梗死范圍（P＜0.01）;模型組大鼠血清cTn-Ⅰ水平較假手術組和空白組顯著升高(P＜0.01)，

9、地爾硫草組、大蒜辣素中、高劑量組血清cTn-Ⅰ水平較模型組顯著降低(P＜0.05)，但大蒜辣素低劑量組血清cTn-Ⅰ水平與模型組比較差異無顯著性（P＞0.05）;與模型組比較，各藥物治療組血清CK-MB和Mb水平均有降低趨勢，但各組CK-MB水平差異無顯著性，只有大蒜辣素高劑量組血清Mb水平與模型組比較差異有顯著性(P＜0.05)。
　　(2)氧化應激指標
　　模型組大鼠SOD和GSH-Px較空白對照組和假手術組均有降低趨勢

10、，而地爾硫革組和大蒜辣素低、中、高劑量組血清SOD和GSH-Px水平較模型組也有升高趨勢，但各組間差異均不顯著(P＞0.05);模型組CAT水平較假手術組顯著升高(P＜0.01)，地爾硫革組和大蒜辣素各劑量組與模型組比較顯著降低(P＜0.05);而對于血清MDA水平，模型大鼠血清MDA較假手術組明顯增高(P＜0.05)，應用地爾硫革和大蒜辣素治療后，血清MDA水平均有降低趨勢，但只有大蒜辣素中、高劑量組與模型組比較差異具有顯著性(P＜0

11、.05)。
　　2.大蒜辣素對大鼠心肌梗死后心室重塑和心肌纖維化防治作用
　　(1)大鼠超聲心動圖結果
　　大蒜辣素各劑量組左室前壁厚度(LVAWd/s)均較模型組顯著增加（P＜0.05）。而左室后壁厚度(LVP Wd/s)各組之間無顯著差異(P＞0.05)。同時，大蒜辣素各劑量組還可減小收縮期左室內(nèi)徑(LVIDd/s)。通過對射血分數(shù)(EF)、左室短軸縮短率(FS)、每搏輸出量(SV)計算結果顯示，大蒜辣素可明顯改善

12、心功能，EF、FS和SV水平較模型組顯著增高（P＜0.05）。
　　(2)心肌Masson染色及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達結果
　　Masson染色顯示，模型組大鼠心臟纖維組織顯著增多，而各藥物治療組心臟纖維組織減少;免疫組化結果顯示:模型組大鼠心肌纖維化明顯，Ⅰ、Ⅲ型膠原表達量較假手術組顯著增加(P＜0.05），大蒜辣素各劑量組均可抑制心肌纖維化發(fā)展，顯著減少Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(P＜0.05)。
　　(3) TGFβ/S

13、mads通路信號蛋白表達變化
　　與正常組比較，模型組大鼠心肌中TGF-β1、Smad3表達顯著增加(P＜0.05），Smad7表達顯著減少(P＜0.05）。與模型組比較，大蒜辣素中、高劑量組顯著抑制大鼠非梗死區(qū)心肌中TGF-β1和Smad3的表達(P＜0.05)，而Smad7的表達增加(P＜0.05)，大蒜辣素低劑量組與模型組比較差異無顯著性(P＞0.05)。
　　3.大蒜辣素對大鼠心肌成纖維細胞的作用及機制
　　(

14、1)對心肌成纖維細胞增殖分化的影響
　　在細胞形態(tài)學水平，細胞貼壁生長，為星形扁平細胞，無自發(fā)性搏動。24h后正常對照組細胞較稀少，經(jīng)AngⅡ刺激后，細胞數(shù)量增多，大蒜辣素各劑量組細胞數(shù)量較AngⅡ組明顯較少;MTS結果顯示，與正常組心肌成纖維細胞比較，AngⅡ組細胞活力顯著增高，而大蒜辣素高、中、低劑量干預24h后細胞活力較AngⅡ組細胞活力顯著降低(P＜0.01);免疫熒光染色結果顯示，AngⅡ作用24h后，心肌成纖維細胞α-

15、SMA表達較正常組明顯增強，而給予大蒜辣素干預后，α-SMA表達量較AngⅡ組明顯降低。提示大蒜辣素可抑制心肌成纖維細胞增殖分化。
　　(2)心肌成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA和蛋白表達變化
　　qRT-PCR與Western blot結果顯示，AngⅡ刺激后，成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA和蛋白表達量較正常對照組明顯升高(P＜0.05)。與AngⅡ組比較，大蒜辣素高劑量組和大蒜辣素中劑量組Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA和蛋白表達量顯

16、著降低，差異有顯著性(P＜0.01)，但大蒜辣素低劑量組Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA和蛋白表達量與AngⅡ組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　(3)大蒜辣素對心肌成纖維細胞KCa3.1的影響
　?、偈紫葢媚てQ記錄了大蒜辣素對全細胞鉀電流的影響，結果顯示，AngⅡ組細胞全細胞鉀電流的電流密度顯著升高，而大蒜辣素高劑量組可顯著抑制全細胞鉀電流的電流密度，低劑量組和中劑量組電流密度與AngⅡ組比較無顯著差異;應用電流密度繪制

17、鉀通道的激活曲線，顯示大蒜辣素對鉀離子通道的激活性質(zhì)并無影響。
　?、贙Ca3.1在心肌成纖維細胞的增殖和分化過程中發(fā)揮了重要作用，為證明大蒜辣素所影響的鉀電流是否有KCa3.1，在記錄全細胞鉀電流后急性加入KCa3.1特異性阻斷劑TRAM-34進行觀察，所記錄到的電流即為TRAM-34不敏感鉀電流。用全細胞鉀電流減去TRAM-34不敏感鉀電流得到TRAM-34敏感鉀電流，即為KCa3.1電流。與正常組比較，AngⅡ可顯著升高大鼠

18、心肌成纖維細胞KCa3.1的鉀離子電流密度，應用大蒜辣素干預后，大蒜辣素高劑量組電流密度較AngⅡ組顯著降低(P＜0.05)。繪制各組細胞KCa3.1的激活曲線顯示大蒜辣素對KCa3.1離子通道的激活性質(zhì)無顯著影響，說明大蒜辣素抑制KCa3.1鉀電流并非通過影響離子通道的激活性質(zhì)實現(xiàn)，可能通過其他機制影響KCa3.1。
　　(4)心肌成纖維細胞KCa3.1 mRNA及蛋白表達變化
　　為確定大蒜辣素影響KCa3.1的機制，應

19、用qRT-PCR和Western blot檢測了KCa3.1 mRNA及蛋白表達水平變化。結果顯示，AngⅡ可顯著上調(diào)心臟成纖維細胞KCa3.1離子通道m(xù)RNA和蛋白表達(P＜0.01)，而大蒜辣素各劑量組成纖維細胞KCa3.1離子通道m(xù)RNA和蛋白表達較AngⅡ組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(5)大蒜辣素下調(diào)KCa3.1作用與H2S信號通路的關系
　　H2S是具有心臟保護及抗纖維化作用的信號分子，大蒜

20、辣素可作為H2S供體發(fā)揮心肌保護作用。通過應用H2S合成酶抑制劑PAG發(fā)現(xiàn)，PAG可顯著抑制大蒜辣素對KCa3.1 mRNA和蛋白表達的調(diào)節(jié)作用。加入PAG后，大蒜辣素下調(diào)KCa3.1表達的作用被取消，與大蒜辣素組比較差異有顯著性（P＜0.05），說明大蒜辣素對KCa3.1的調(diào)節(jié)作用與H2S信號通路有關。
　　結論:
　　1.大蒜辣素在大鼠心肌梗死造模后即刻給藥能對缺血心肌產(chǎn)生保護作用，可明顯減小心肌梗死范圍、降低血清心肌梗

21、死標志物水平并改善氧化應激指標。
　　2.大蒜辣素在心肌梗死造模后長期給藥可抑制心室重塑、改善心功能，同時也可抑制心肌纖維化的發(fā)展，其機制與調(diào)節(jié)TGFβ/Smads信號通路有關。
　　3.大蒜辣素在細胞水平可抑制心肌成纖維細胞增殖分化，減少心肌成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達。
　　4.大蒜辣素還可抑制心肌成纖維細胞KCa3.1電流密度，這一作用與影響KCa3.1的激活性質(zhì)無關，而是通過下調(diào)細胞KCa3.1通道表達而實