C5-siRNA對大鼠心肌缺血損傷的保護作用.pdf

1、研究背景：
　　 心肌缺血再灌注(myocardial ischemia and reperfusion，MI/R)損傷是指缺血心肌組織在恢復血液灌注后發(fā)生的細胞死亡或功能降低。在缺血與再灌注的過程中，尤其是再灌早期，大量補體迅速激活，其激活劑不僅包括抗原抗體復合物、粘多糖、組織蛋白酶、病毒、細菌、特異性哺乳動物細胞、免疫球蛋白聚合體，而且缺血心肌細胞線粒體本身就可釋放一些特異性分子經(jīng)經(jīng)典途徑激活補體系統(tǒng)，補體激活級聯(lián)反應的終產(chǎn)

2、物一攻膜復合物(C5b-9)和多聚C9沉積在缺血區(qū)，與心肌梗死面積有直接關系，是導致細胞死亡的直接因素。因此，針對特異性補體成分C5的治療，在C5水平抑制補體級聯(lián)反應以阻止膜攻擊復合物的形成和過敏毒素C5a的產(chǎn)生，而仍維持重要補體功能，如調(diào)理和免疫復合物清除等，具有重要意義。
　　 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年發(fā)展起來的研究轉錄后剪切的-種實驗方法。它將目的基因所對應的雙鏈RNA導入生物體，導致

3、相應的mRNA降解，從而使目的基因沉默。我們在本實驗中利用RNA干擾技術選擇性阻斷了補體晚期激活產(chǎn)物C5的表達而抑制補體激活，這樣既可達到減輕心肌損傷的目的，又可保留機體必要的免疫功能。
　　 目的：
　　 本課題分為四部分，研究采用RNA干擾技術，通過沉默C5補體激活產(chǎn)物的表達而抑制心肌缺血區(qū)補體的激活，進而探討其對心肌缺血再灌注的影響。
　　 (1)構建小鼠C5基因特異性siRNA慢病毒載體，并對其進行功能性

4、研究。(2)改進和完善大鼠急性心肌缺血再灌注損傷動物模型的制備及評估。(3)研究C5-siRNA對大鼠心肌缺血的保護作用。(4)觀察C5-siRNA對大鼠心肌缺血的心肌組織病理學的影響。
　　 方法：
　　 (1)選取C5基因的19nt特異性序列，設計針對C5的siRNA序列，應用基因重組技術插入到pGCSIL-GFP慢病毒表達載體中，Age I和EcoR I進行雙酶切和DNA測序鑒定重組克隆，重組病毒質粒及其3種輔助包

5、裝原件載體質粒通過Lipofectamine 2000共轉染293T細胞，培養(yǎng)48h后，收集細胞培養(yǎng)上清液，將其濃縮后在293細胞中測定病毒滴度。
　　 (2)健康SD大鼠隨機分為3組：假手術組(Sham組)，僅穿線，不結扎LAD；缺血組(Ischemia組)，單純結扎LAD30min；缺血再灌注組(IR組)，結扎LAD30min，再灌注120min。每組20只。并從造模成功率、心電圖、外周血中LDH、CK-MB的含量測定、心肌

6、病理組織學檢查等方面對改進后的模型進行評估。
　　 (3)30只SD大鼠隨機分為假手術組(Sham組)，對照組(Control組)和C5-siRNA干預組。結扎對照組和干預組大鼠的冠狀動脈前降支近端制備急性大鼠心肌缺血模型，予冠脈前降支支配的中心區(qū)分別注射生理鹽水和C5-siRNA，1小時后松扎，測定血流動力學參數(shù)，心電圖改變及血清LDH和CK-MB變化。
　　 (4)30只SD大鼠隨機分為假手術組(Sham組)，模型組

7、(Ischemia組)和C5-siRNA干預組。結扎模型組和干預組大鼠的冠狀動脈前降支近端制備急性大鼠心肌缺血模型，予冠脈前降支支配的中心區(qū)分別注射生理鹽水和C5-siRNA，實驗結束后測定心臟指數(shù)，光鏡觀察心肌形態(tài)學改變及C5的免疫組織化學染色。
　　 結果：
　　 (1)通過對pGCSIL-GFP-C5-siRNA載體進行雙酶切鑒定，證實短發(fā)夾RNA正確插入慢病毒載體。DNA測序證實插入的序列正確，C5基因RNA干擾

8、重組慢病毒載體經(jīng)293細胞包裝成功，收集293細胞分泌的病毒上清測定病毒的滴度為5×107U/mL。
　　 (2)改進后的造模成功率達到90％以上，血液動力學、心電圖、外周血中LDH、CK-MB的含量測定、心肌病理組織學檢查等方式均證實改良后的動物模型成功。
　　 (3)C5-siRNA對心肌缺血損傷大鼠血流動力學指標均有一定的改善趨勢；C5-siRNA能縮小大鼠結扎冠脈后心電圖缺血范圍(N-ST)及心肌缺血程度(ST段

9、位移值)，減輕病理學損傷；對嚴重的心肌缺血引起的血清LDH和CK-MB升高也有明顯降低作用，尤其是其中CK-MB與模型組相比差異顯著(1109±245 U/L vs 1513±335 U/L)(P<0.05)。
　　 (4)C5-siRNA對心肌缺血損傷大鼠的心臟指數(shù)沒影響，C5-siRNA能減輕心肌缺血的病理學損傷。免疫組織化學結果顯示，模型組與干預組的C5表達量均明顯高于假手術組(P<0.001)，而干預組的C5表達量雖與模

10、型對照組相比有所降低，但二者沒有統(tǒng)計學意義的差別(P=0.132)。
　　 結論：
　　 (1)成功構建小鼠C5 siRNA曼病毒載體，為研究C5在心肌缺血再灌注損傷中的影響提供了穩(wěn)定感染細胞載體。
　　 (2)改進后的方法能大大降低手術難度，提高模型成功率和動物成活率，準確地復制心肌缺血再灌注損傷的實驗模型，簡化實驗操作步驟。
　　 (3)C5-siRNA對大鼠急性心肌缺血具有保護作用。